宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變MGMT基因甲基化及其相關(guān)性研究

陸歡　陳瑩蓉　孫立奇　陶志梅　張甦　鄧再興　戴利成

宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變MGMT基因甲基化及其相關(guān)性研究

陸歡陳瑩蓉孫立奇陶志梅張甦鄧再興戴利成

【摘要】目的探討宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）患者宮頸脫落細(xì)胞中O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在宮頸癌臨床早期診斷和篩查中的作用。方法選取對(duì)照組20例，CINI、CINII、CINIII期患者各50例和宮頸癌患者50例，采用甲基化特異性PCR檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞中MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)并進(jìn)行比較。結(jié)果宮頸癌和CINI、II、III期患者M(jìn)GMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率分別為82.0%（41/50）、24.0%（12/50）、50.0%（25/50）和80.0%（40/50），而對(duì)照組未檢測(cè)到MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化。與對(duì)照組比，宮頸癌組和CINI、II、III期組MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。宮頸癌組中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化與其臨床分期及組織分化程度有顯著相關(guān)性（均P＜0.05）。結(jié)論MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，有助于宮頸癌的早期輔助診斷和篩查。

【關(guān)鍵詞】宮頸癌O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化

宮頸癌目前發(fā)病率居女性惡性腫瘤第二位，僅次于乳腺癌，是一種嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤。宮頸癌的發(fā)展經(jīng)歷宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）期，故檢查宮頸癌癌前病變，并采取有效的治療是阻斷宮頸癌發(fā)展的有效方法。O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)基因啟動(dòng)子甲基化可導(dǎo)致基因表達(dá)失活，使一些同腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化而引起腫瘤[1]。有研究表明MGMT基因的甲基化與宮頸癌的發(fā)生存在相關(guān)性[2]，然而同時(shí)檢測(cè)宮頸癌和CIN患者M(jìn)GMT基因甲基化的報(bào)道目前鮮見(jiàn)。本研究對(duì)宮頸癌和CIN患者宮頸脫落細(xì)胞中的MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，探討其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義，旨在為宮頸癌的早期輔助診斷和篩查提供參考。

1　資料和方法

1.1一般資料選取2007-01—2013-07湖州市婦幼保健院診斷的CIN及宮頸癌患者200例。其中CINⅠ組50例，年齡31～75（47.6±8.6）歲；CINⅡ組50例，年齡29～74（44.3±10.5）歲；CINⅢ組50例，年齡31～70（42.4± 7.5）歲；宮頸癌組50例，年齡30～75（43.5±10.8）歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)，宮頸癌臨床分期：Ib期18例，Ⅱa期28例，Ⅲa期4例。組織學(xué)分級(jí)：低分化3例，中分化37例，高分化10例。另?yè)裢簩?duì)照組（慢性宮頸炎、子宮肌瘤等無(wú)宮頸病變者）20例，年齡27～76（44.9±10.3）歲。各組患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批后進(jìn)行，患者均簽訂知情同意書(shū)。

1.2標(biāo)本采集采集宮頸脫落細(xì)胞，置于5ml宮頸脫落細(xì)胞保存液中，取1ml樣本置于1.5ml離心管中，12 000r/ min離心5min，去上清液，再加入500μl的1×TBS，12 000 rpm離心5min，去上清液，沉淀即為收集的細(xì)胞，-20℃保存。

1.3主要試劑DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司，TakaRa Ex Taq耐熱性DNA聚合酶、Marker為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.4方法

1.4.1DNA提取嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用分光光度儀測(cè)定OD260、OD280，計(jì)算濃度及OD260/OD280比值，OD260/OD280比值≥1.8的DNA為合格樣本。

1.4.2DNA亞硫酸氫鈉修飾將提取的DNA作亞硫酸氫鈉鹽修飾，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3甲基化特異性PCR針對(duì)亞硫酸氫鈉處理后CpG位點(diǎn)的改變，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成兩對(duì)引物：甲基化引物（5＇-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3＇,5＇-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3＇），生成片段為83 bp，非甲基化引物（5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3＇,5＇-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3＇），生成片段為91 bp，分別用于擴(kuò)增MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與非甲基化狀態(tài)。甲基化特異性PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4.4甲基化分析基因甲基化率=基因甲基化數(shù)/總標(biāo)本數(shù)×100%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2.1MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1；各組MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率見(jiàn)表1。

由圖1可見(jiàn)，宮頸癌組和CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ組與對(duì)照組比較MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；CINⅠ和Ⅱ組與宮頸癌組比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ組MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果（M：甲基化；U：非甲基化；A：對(duì)照組；B：CINⅠ組；C：CINⅡ組；D：CINⅢ組；E：宮頸癌組；Marker：50～100 bp）

表1　各組MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率比較

2.2不同分期和病理類(lèi)型宮頸癌MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與臨床特征的關(guān)系

表2　不同分期和病理類(lèi)型宮頸癌MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與臨床特征的關(guān)系

由表2可見(jiàn)，不同分期的宮頸癌MGMT基因甲基化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相關(guān)性分析表明，臨床分期與MGMT基因甲基化率呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.898，P＜0.05）。不同組織學(xué)分化程度的宮頸癌MGMT基因甲基化率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；相關(guān)性分析表明，組織分化程度與MGMT甲基化率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.964，P＜0.05）。

3　討論

宮頸癌是全球婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的第二位最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占所有婦科腫瘤的15%。宮頸癌是唯一可以早期發(fā)現(xiàn)的婦科疾病，采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段診斷癌前病變，及時(shí)采取措施，即可保證女性重新過(guò)上健康生活。因此，尋找早期診斷和篩查宮頸癌的生物標(biāo)記物意義重大。

基因組DNA抑癌基因的異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)多種基因在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)生了甲基化修飾，且這種表觀遺傳學(xué)改變與宮頸病變程度有一定相關(guān)性。研究者采用多種方法分析了宮頸脫落細(xì)胞、宮頸活檢組織和血漿標(biāo)本等，提出DNA甲基化可能用于宮頸癌篩查[3-4]。MGMT是人類(lèi)DNA修復(fù)系統(tǒng)中最重要的直接修復(fù)酶，在細(xì)胞內(nèi)主要修復(fù)DNA的O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤的損傷，可保護(hù)染色體免受烷化劑的致突變、致癌和細(xì)胞毒反應(yīng)的損傷。MGMT基因和大多數(shù)管家基因一樣，啟動(dòng)子缺少TATA盒和CAAT盒，但一些區(qū)域富含GC序列。腫瘤抑制基因和其他一些腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子或5＇端內(nèi)高度甲基化是人類(lèi)腫瘤的一個(gè)共同特點(diǎn)，且常常導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄終止和相關(guān)蛋白丟失。由于MGMT基因具有這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，故被認(rèn)為其啟動(dòng)子中CpG島的過(guò)度甲基化會(huì)降低基因的表達(dá)，導(dǎo)致該基因轉(zhuǎn)錄的蛋白表達(dá)減少。在2009年相繼發(fā)表的3篇關(guān)于宮頸癌相關(guān)基因甲基化研究的文章中[5-7]，分別報(bào)道了不同人群（美國(guó)、韓國(guó)、希臘）不同的幾組基因，這幾組基因的甲基化改變都與宮頸癌病程的發(fā)展有一定的相關(guān)性。其中僅MGMT基因?yàn)檫@幾組基因中唯一一個(gè)重復(fù)出現(xiàn)的基因。提示了該基因的甲基化情況與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)具有較強(qiáng)的可靠性。

本研究對(duì)宮頸癌和CIN患者宮頸脫落細(xì)胞中的MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，探討其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義，為宮頸癌的早期輔助診斷和篩查提供更有效的方法。本研究結(jié)果顯示，甲基化MGMT只在宮頸癌和CIN患者中有表達(dá)，50例宮頸癌患者中，甲基化率達(dá)82%。而正常對(duì)照組中未檢測(cè)到MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，這提示MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化在宮頸癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著一定作用。宮頸癌的發(fā)展是從宮頸不典型增生到宮頸原位癌再到宮頸浸潤(rùn)癌的漸進(jìn)過(guò)程，其中有一個(gè)間隔較長(zhǎng)的并可逆轉(zhuǎn)的癌前病變時(shí)期-CIN期。CIN分為CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ，各級(jí)CIN均有發(fā)展為浸潤(rùn)癌的趨勢(shì)，級(jí)別越高發(fā)展為浸潤(rùn)癌的機(jī)會(huì)越多，級(jí)別越低，自然退縮的機(jī)會(huì)越多。研究表明，宮頸浸潤(rùn)癌5年存活率為67%，CIN為 100%[8]。本研究結(jié)果提示CIN作為宮頸癌的癌前病變階段，其MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率隨級(jí)別的升高而呈遞增趨勢(shì)，所以MGMT基因甲基化檢測(cè)作為一種新的分子生物學(xué)指標(biāo)可能為宮頸癌的早期輔助診斷和篩查提供了更有效的方法。本研究還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化與其臨床分期及組織分化程度有顯著相關(guān)性。表現(xiàn)為隨著臨床分期的增加，MGMT甲基化率也隨之升高；腫瘤惡性程度越高，分化程度越低，MGMT甲基化狀態(tài)也越普遍。

綜上所述，MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與宮頸癌之間存在著密切聯(lián)系。同時(shí)，研究也提示，MGMT基因啟動(dòng)區(qū)高甲基化是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的早期事件，可作為新的腫瘤標(biāo)記物，有助于宮頸癌的早期輔助診斷和治療。

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（本文編輯：沈昱平）

收稿日期：（2014-08-22）

基金項(xiàng)目：湖州市科技局自然資金課題（2010YZ02）

作者單位：313000湖州市婦幼保健院婦產(chǎn)科（陸歡、孫立奇、陶志梅、張甦），病理科（鄧再興）；湖州市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（陳瑩蓉、戴利成）

通信作者：戴利成，E-mail：dlc21@126.com

Relationship between methylation of MGMT gene promoter and cervical carcinoma

【Abstract】ObjectiveTo investigate the methylation status of MGMT gene promoter in cervical carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia(CIN).MethodsMethylation status of MGMT gene promoter was detected with methylation specific PCR (MSP)in cervical exfoliated cells from patients with CINI(n=50),CINII(n=50),CINIII(n=50),cervical carcinoma(n=50)and non-cancer controls(n=20).ResultsThe promoter methylation rates of MGMT were 82.0%(41/50),24.0%(12/50),50.0%(25/50) and 80.0%(40/50)in cervical carcinoma,CIN I,CINII and CINIII,while no methylation was detected in control group(P＜0.05). The methylation of MGMT gene was correlated with the clinicopathological characteristics and tissue differentiation of cervical carcinoma(P＜0.05).ConclusionThe methylation of MGMT gene promoter region is associated with cervical carcinoma,which may be used as potential marker for early diagnosis of cervical carcinoma.

【Key words】Cervical carcinomaMGMTMethylation