麻疹患兒糞便麻疹病毒核酸的檢測及臨床意義

趙仕勇　林先耀　王娟　吳亦棟　祁正紅　邵啟民　崔大偉

麻疹患兒糞便麻疹病毒核酸的檢測及臨床意義

趙仕勇林先耀王娟吳亦棟祁正紅邵啟民崔大偉

【摘要】目的探討麻疹患兒腸道排毒情況和糞便病毒核酸快速檢測的臨床意義。方法38例臨床診斷麻疹患兒，入院時均有發熱、皮疹等麻疹感染癥狀。在入院2d內同時采集咽拭子和糞便標本。標本在冷鏈條件下送傳染病診治國家重點實驗室，采用RT-PCR法檢測麻疹病毒核酸及Ct值。同時對部分咽拭子和糞便標本擴增均陽性的PCR產物進行基因測序。結果38例患兒糞便麻疹病毒核酸陽性37例，占97.4%，Ct值23.8±3.04；咽拭子病毒核酸陽性35例，占92.1%，Ct值28.0±4.0。兩者陽性率比較，差異無統計學意義（χ2=0.029，P＞0.05）；兩組Ct值比較，差異有統計學意義（t=5.23，P＜0.05）。3例患兒咽拭子和糞便標本的麻疹病毒基因型（均為H1a基因亞型）和核苷酸序列完全一致。結論糞便病毒核酸快速檢測與咽拭子標本具有相同的臨床診斷價值，糞便病毒核酸拷貝數高于咽拭子病毒核酸，且糞便標本的采集具有方便、無痛苦，依從性好，不易受人為因素的影響，值得推廣。

【關鍵詞】麻疹糞便病毒核酸熒光定量RT-PCR

麻疹是由麻疹病毒（Measles virus，MV）引起的一種以發熱、呼吸道癥狀和出疹為特征的急性呼吸道傳染病,嚴重危害兒童健康。我國進行麻疹疫苗計劃免疫之后,該病的發病率明顯下降，但是近年來其發病率和病死率又呈現上升趨勢。早期明確實驗室診斷有利于早期防控和及時救治。目前病毒診斷和排毒規律研究最多的是采用咽拭子標本。我院采用RT-PCR法直接測定麻疹患兒糞便MV核酸，探討麻疹患兒腸道排毒情況和糞便病毒核酸快速檢測的臨床意義，現報道如下。

1　資料和方法

1.1一般資料選擇2013-03—06我院感染科住院資料完整的麻疹患兒38例，診斷符合諸福棠《實用兒科學》第7版的相關定義。入院時均有發熱、皮疹等麻疹感染癥狀，均無接種麻疹疫苗史。病例組，男25例，女13例；最小2個月，最大6歲；≤8個月32例，＞8個月6例。在入院2d內同時采集咽拭子和糞便標本。擇同期住院普通嬰幼兒下呼吸道感染患兒38例糞便標本作為對照組，男24例，女14例；年齡4～8個月30例，9～24個月8例。兩組性別、年齡均有可比性（均P＞0.05）。

1.2標本的采集和運送咽拭子和糞便標本在冷鏈條件下送傳染病診治國家重點實驗室檢測MV核酸。樣本的采集、運輸等均參照2009年中華人民共和國衛生部頒布的《全國麻疹監測方案》。

1.2.1標本處理和病毒核酸提取取咽拭子采集管中200μl病毒液，按照VR100病毒核酸提取試劑盒（中國臺灣Geneaid公司）說明書操作抽提MV核酸，收集終體積為50μl的核酸提取液，-80℃保存。

1.2.2糞便標本處理取0.2g或200μl糞便樣本加到EP管中，加入0.9%氯化鈉溶液1.5ml，震蕩混勻3次，每次10s，然后靜置10min，以8 000r/min離心5min，吸取200μl上清液加到EP管中，進行核酸提取，-80℃保存。酶標儀是美國BIO-RAD公司的RIMARK酶標儀。1.3檢測方法

1.3.1引物設計參考美國CDC和相關文獻[2-3]，根據GenBank中MV基因序列號（NM_KC164757.1），采用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計用于擴增MV的N基因C末端的594個核苷酸（bp）片段的引物，引物由上海生工公司合成。上游引物（MV-60）:5＇-GCTATGCCATGGGAGTAGGAGTGG-3＇；下游引物（MV-63）：5＇-CCTCGGCCTCTCGCACCTAGT-3＇。

1.3.2MV核酸檢測采用RT-PCR法，按照試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書操作，將MV核酸逆轉錄為cDNA，然后對cDNA進行PCR擴增。反應體系：10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5μl，dNTP mixture（各2.5mmol/L）2.0μl，TaKaRaTaq酶（5U/μl）0.15μl，10 μmol/L上、下游引物各1μl，cDNA 3μl，ddH2O補足至25μl。循環參數：95℃預變性5min；95℃30s，53℃45s，72℃1min，共40個循環；72℃延伸10min，4℃終止反應。分別以滅菌ddH2O和實驗室分離培養的MV核酸作為陰、陽性對照的模板。PCR產物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并拍照。

1.3.3分析條件和結果判斷陰性對照：核酸提取時以滅菌雙蒸水代替標本。陽性對照：提取好的陽性核酸作為模板RNA。閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準，或可根據儀器噪音情況進行調整。Ct值無數值的標本為陰性樣本；Ct值＜35.0的樣本為陽性；Ct值≥35.0的樣本建議重做。重做結果無數值者為陰性，否則為陽性。

1.3.4基因測序選擇3例咽拭子和糞便標本擴增均陽性的PCR產物委托深圳華大基因杭州分公司對基因序列進行雙向測定。測序結果用DNAMAN（5.1.0.0）與Sequencher 4.7軟件進行序列的拼接、比對和分析，利用MEGA4.0軟件與DNAstar 5.1對MV的N基因C末端456個核苷酸序列進行同源性分析。

1.4統計學處理采用SPSS 18.0統計軟件，測得計量資料以表示，組間比較采用配對樣本t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。

2　結果

2.1咽拭子和糞便標本病毒核酸陽性率和Ct值的比較病例組咽拭子病毒核酸陽性35例占92.1%，Ct值28.0±4.0；而糞便病毒核酸陽性37例占97.4%，Ct值23.8±3.04。兩者陽性率比較，差異無統計學意義（χ2= 0.029，P＞0.05）；兩組Ct值比較，差異有統計學意義（t= 5.23，P＜0.05）。說明糞便病毒核酸拷貝數高于咽拭子病毒核酸。見圖1。對照組咽拭子、糞便MV核酸均陰性。

圖1　MV N基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖（M：DNA marker DL2 000；1：陰性對照；2～5：麻疹患者標本；6：陽性對照）

2.2基因測序結果3例患兒咽拭子和糞便標本的MV基因型（均為H1a基因亞型）和核苷酸序列完全一致，見圖2。

圖2　MV基因測序圖

3　討論

盡管在全球和地區水平上麻疹疫苗接種覆蓋率穩定上升，而且報道的加強免疫覆蓋率提高，但是2010年全球麻疹病例數仍然在上升[1]。國家衛生計生委公布我國2012年麻疹發病數6 183例，死亡數8例；2013年麻疹發病數27 646例，死亡數24例；發病數和死亡數均增加3倍以上。其中兒童麻疹的發病率占很大比例。麻疹是一種傳染性很強的急性呼吸道傳染病，也是我國法定的乙類傳染病之一，典型病例可根據臨床表現結合流行病學作出診斷。由于麻疹的臨床表現與其他部分呼吸道感染非常相近，接種過疫苗或使用過其他免疫增強劑后感染MV的不典型病例占較大的比例，這些均給麻疹的診斷帶來一定困難，也在一定程度上影響了麻疹治療和防疫工作的及時性，故麻疹的早期診斷、早期隔離尤為重要。MV感染最常見、最明顯的病理特征是多核巨噬細胞的形成，MV巨細胞可在呼吸道分泌物、尿液和黏膜表面如喉部、鼻腔、尿液、頰黏膜和結膜中找到，其出現的時間以出疹前2d至出疹后1d最為多見，此時采集上述各部位標本進行檢測，有助于臨床對MV感染做出早期診斷[2]。目前臨床診斷麻疹的實驗室手段主要是用ELISA法檢測MV特異性IgM抗體，但在感染初期以及免疫功能低下的患者中該抗體的滴度較低，ELISA法檢測可能為陰性。近年發展起來的RT-PCR方法檢測病毒核酸具有直觀、重復性好、特異性強、敏感性高、易操作和時間短等優點，更適用于病例的早期確診，以便在短時間內快速作出診斷。出疹3d內麻疹患者咽拭子標本中檢出MV核酸為92.86%（13/14），顯著高于病毒分離法的42.86%和ELISA法的71.43%[2]。張淑芹等[3]報道不典型麻疹患者咽拭子、尿殘渣MV抗原檢出率分別為82.4%和94.1%，表明咽拭子和尿殘渣標本MV抗原檢測對不典型麻疹的早期診斷有重要價值。同時說明麻疹患兒從咽部和尿排毒。本研究應用RT-PCR對麻疹患兒糞便標本進行MV核酸檢測，發現陽性率達97.4%，高于咽拭子檢測的病毒核酸陽性率，雖然無統計學差異，但至少說明糞便標本檢測MV核酸與咽拭子標本有相同的臨床意義，尤其對咽拭子標本陰性患兒有重要診斷價值。因咽拭子采集的質量與操作人員的技術密切相關,每個人采集的部位、涂抹的次數多少不同,其病毒分離成功率會有較大差異[4]，故易對標本檢測結果的準確性造成影響。而糞便病毒核酸快速檢測方法（RT-PCR）方便可行，患兒依從性更好，且特異性及敏感性均高，可在發熱初期患兒的糞便標本中檢測出MV，同時不受標本量的限制，更適合作為早期診斷的實驗室檢查依據，為臨床醫生的診斷提供幫助。同時說明MV可經腸道排泄。黃芳等[5]報道甲型H1N1流感患者糞便標本病毒核酸陽性率為57.14%（8/14）；陽性標本采樣時間為發病后1～4d，說明發病早期糞便標本也可檢出甲型H1N1流感病毒，但糞便標本的病毒核酸陽性持續時期短于咽拭子標本，說明甲型H1N1流感通過消化道排毒時期短于呼吸道的咽部。麻疹患兒通過消化道排毒時期是否短于呼吸道的咽部有待于進一步研究。另本研究發現麻疹患兒糞便病毒核酸Ct值低于咽拭子，說明糞便標本病毒拷貝數高于咽拭子標本。至于糞便病毒陽性與疾病時間的相關性還有待深入研究。

總之，麻疹患兒病毒可通過腸道排泄，應用RTPCR快速檢測麻疹患兒糞便病毒核酸與咽拭子標本具有相同重要的診斷價值，而檢測糞便標本具有采集方便、患兒依從性好、不易受人為因素的影響等優點，是實驗室診斷麻疹的重要方法之一，建議臨床推廣應用。至于麻疹患兒病毒通過腸道排泄持續時間有待進一步研究明確。

4　參考文獻

[1]龔震宇,楊小平.全球麻疹控制與消除的進展情況[J].疾病監測,2012, 27(6):503-504.

[2]姜明,杰甘云,梁勇,等.熒光定量聚合酶鏈反應法快速檢測麻疹病毒核酸[J].中國衛生檢驗雜志,2007,17(4):220-221.

[3]張淑芹,趙文靜,王瑩,等.間接免疫熒光法檢測[J].中華實驗和臨床感染病雜志,2010,4(4):390-394.

[4]孫英杰,余宏杰,馬艷,等.麻疹病人不同標本的麻疹病毒分離結果[J].中國計劃免疫,2002,8(1):11-13.

[5]黃芳,石偉先,盧桂蘭,等.不同類型樣本在甲型HI N1流行性感冒診斷及研究中的意義[J].中華預防醫學雜志,2010,44(12):1079-1082.

（本文編輯：沈昱平）

收稿日期：（2014-05-27）

基金項目：浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2012KY13159）

作者單位：310014杭州市兒童醫院感染科（趙仕勇、林先耀、王娟、吳亦棟、祁正紅、邵啟民）；浙江大學傳染病診治國家重點實驗室（崔大偉）

通信作者：趙仕勇，E-mail：jhzsyhj@163.com

Value of stool samples in detection of viral nucleic acid in Children with measles

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the application of stool samples in detection of nucleic acid in children with measles. MethodsThirty eight children with a clinical diagnosis of measles were admitted in Hangzhou Children's Hospital from March to June 2013.The throat swabs and stool specimens were collected within 2 days of admission.The specimens were examined with fluorescence quantitative RT-PCR for nucleic acid of measles virus.ResultsThe viral nucleic acid was positive in 37 stool specimens(97.4%)with a Ct value of 23.8±3.04 and in 35 throat swabs samples(92.1%)with a Ct value of 28.0±4.0,respectively(positive rate:χ2=0.029,P＞0.05;Ct value:t=5.23,P＜0.05).The amplified PCR products were positive in gene sequencing. ConclusionThe stool sample has the same diagnostic value as throat swab specimens in detection of measles viral nucleic acid and the former is more convenient with better compliance for collection.

【Key words】MeaslesStoolNucleic acidFluorescent quantitativnRT-PCR