趨化因子CCL22誘導肺癌細胞轉移中ERK/p38MAPK蛋白的表達

管彩虹 樓雅芳 趙凱 朱黎紅 吳清

趨化因子CCL22誘導肺癌細胞轉移中ERK/p38MAPK蛋白的表達

管彩虹 樓雅芳 趙凱 朱黎紅 吳清

目的 探討趨化因子CCL22誘導肺癌細胞轉移過程中ERK/p38MAPK蛋白的表達。方法 以100ng/ml的CCL22誘導肺癌細胞SBC-5后，采用細胞劃痕試驗和Transwell試驗觀察細胞遷移和侵襲能力的變化及加入蛋白激酶抑制劑U0126后細胞遷移和侵襲能力的變化。以Western blot法檢測細胞中p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達情況。結果 加入100ng/ml的CCL22后，對照組、CCL22組、混合組SBC-5細胞平均遷移距離分別為（112．6±27．2）、（351．9±16．4）、（145．1±29．6）μm，CCL22組細胞遷移距離明顯大于對照組和混合組（均P＜0．05）。對照組、CCL22組、混合組平均侵襲細胞數分別為（199．2±32．8）、（505．5±66．3）、（95．7±19．1）個，CCL22組顯著高于對照組和混合組（均P＜0．05），而混合組明顯低于對照組（P＜0．05）。100ng/ml的CCL22誘導后，p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達增加，U0126可減低以上蛋白的表達（P＜0．05）。結論 ERK/p38MAPK蛋白激酶參與了趨化因子CCL22誘導的肺癌細胞遷移和侵襲。

肺癌 趨化因子CCL22 細胞外信號調節激酶 p38絲裂原活化蛋白激酶 腫瘤轉移

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤，常發生骨、肝臟等遠處轉移，迄今為止其侵襲和轉移的機制尚未完全明確。以往研究發現，分化的破骨細胞可產生趨化因子CCL22，其相應的受體為趨化因子受體4（CCR4）。CCL22能誘導表達CCR4的人肺癌細胞系SBC-5細胞發生遷移[1]，同時研究也發現破骨細胞在分化與激活過程中還產生多種細胞因子，這些細胞因子與不同的調節蛋白結合后能激活多信號傳導通路。而目前對于細胞外信號調節激酶/絲裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）通路是否參與肺癌轉移，尚未見報道。本研究以SBC-5細胞為實驗對象，觀察CCL22誘導下肺癌細胞遷移和侵襲能力的變化，并檢測細胞內ERK和p38MAPK蛋白表達的情況，進一步探討ERK/p38MAPK信號通路在肺癌細胞遷移和侵襲中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器 人肺癌細胞系SBC-5細胞購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。RPMI-1640培養基、蛋白激酶抑制劑U0126購于美國Sigma公司。化學發光試劑（ECL）Plus試劑盒、IP細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天公司。ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK和GAPDH抗體購于美國Santa Cruz公司。ECLIPSE Ti-S型倒置相差顯微鏡為日本Nikon公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 SBC-5細胞復蘇后以含10% FBS的RPMI-1640培養基常規培養，并調整細胞狀態。本研究預實驗中采用不同濃度CCL22誘導SBC-5細胞，侵襲實驗及Western blot均顯示100ng/ml作用24h誘導效果最明顯（本文中未顯示相關結果），因此本研究CCL22濃度選擇100ng/ml。設對照組、CCL22組（100ng/ ml）、混合組（100ng/ml CCL22+10μmol/L U0126），分別培養24h后進行檢測。

1.2.2 劃痕實驗觀察細胞遷移能力 取對數生長期細胞，以1×106/孔細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后，同步化培養24h。用200μl移液器尖端垂直6孔板底部劃線，以無血清RPMI-1640培養基漂洗兩遍。各組細胞培養24h后，在倒置相差顯微鏡下選擇背景最好的3個視野拍照（×100）。

1.2.3 Transwell試驗觀察細胞侵襲能力 取對數生長期細胞，同步化培養24h。以無血清RPMI-1640培養基稀釋，取100μl稀釋液加到24孔transwell上室，下室加入600μl各組培養基。每組加入相應藥物，培養24h后用棉簽擦去上室非侵襲細胞，移去transwell，予倒置風干，取4個視野（×100），染色、照相后計數穿膜細胞數。1.2.4 Western blot檢測細胞中p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達 收集各組細胞，提取蛋白質，分別加入1:500稀釋的ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK和GAPDH抗體，4℃過夜后加入HRP標記的二抗，室溫搖動2h。TBS-T漂洗，ECL顯色。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較行多個樣本均數比較的方差分析。

2 結果

2.1 CCL22對SBC-5細胞遷移能力的影響 100ng/ml的CCL22誘導后，對照組SBC-5細胞平均遷移距離（112.6±27.2）μm，CCL22組細胞平均遷移距離（351.9± 16.4）μm，混合組細胞平均遷移距離（145.1±29.6）μm。CCL22組細胞遷移距離明顯大于對照組和混合組（均P＜0.05），混合組和對照組相比無統計學差異（P＞0.05），見圖1。

2.2 CCL22對SBC-5細胞侵襲能力的影響 100ng/ml的CCL22誘導SBC-5細胞24h后，對照組平均穿膜細胞數（199.2±32.8）個，CCL22組平均穿膜細胞數（505.5±66.3）個，混合組平均穿膜細胞數（95.7±19.1）個。CCL22組顯著高于對照組和混合組（均P＜0.05），混合組明顯低于對照組（P＜0.05），見圖2。

圖1 培養24h后各組SBC-5細胞遷移能力的變化（A：對照組0h；B：CCL22組0h；C：混合組0h；D：對照組24h；E：CCL22組24h；F：混合組24h；×100）

圖2 培養24h后各組SBC-5細胞侵襲能力的變化（A：對照組；B：CCL22組；C：混合組；HE染色，×100）

2.3 CCL22對SBC-5細胞p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達的影響 100ng/ml的CCL22誘導12h和24h后，SBC-5細胞p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達呈上升趨勢，并呈時間依賴性，而U0126可顯著性減低CCL22引起的蛋白表達增高（P＜0.05），見圖3。

圖3 培養12h和24h后各組SBC-5細胞內p-ERK和p-p38 MAPK蛋白表達

3 討論

在腫瘤細胞轉移的過程中，靶器官的趨化作用至關重要。腫瘤的轉移不是隨機的，而是具有嗜器官性的，趨化因子在其中發揮著重要的作用。近年來的研究證實，靶器官產生的一些細胞因子，如白介素、細胞核因子κB配基受體激活劑、趨化因子等與腫瘤細胞表達的特異性受體結合，在腫瘤細胞的遷移侵襲過程中發揮著重要作用[2]。

趨化因子家族是一類由免疫或非免疫細胞分泌的一級結構相似的小分子蛋白，具有多種生物學活性。根據其氨基酸序列上前兩個半胱氨酸相對位置不同可分為4類，CCL22就是其中一類，在人體中由位于16號染色體的CCL22基因編碼，由樹突狀細胞和巨噬細胞分泌產生。Nakamura等[1]研究發現分化的破骨細胞也可以產生趨化因子CCL22，其相應的受體為CCR4。本實驗發現用100ng/ml的CCL22處理肺癌SBC-5細胞24h后，細胞遷移和侵襲能力明顯增加，說明趨化因子CCL22對肺癌細胞有明顯的趨化作用，加入蛋白激酶抑制劑U0126后，腫瘤細胞的遷移和侵襲能力則明顯減弱。

MAPK是細胞內廣泛存在的絲/蘇氨酸蛋白激酶超家族，是將細胞質的信號傳遞至細胞核并引起細胞核發生變化的重要物質。MAPK信號傳導通路調節著機體細胞的生長、分化、分裂、死亡以及細胞間功能同步化。在目前人類鑒定的4條MAPK通路（ERK、JNK/SAPK、BMK和p38MAPK）中，ERK和p38MAPK途徑為MAPK級聯途徑的原型，在信號傳導過程中起重要作用。既往研究發現U0126主要是抑制ERK磷酸化，ERK可將細胞外刺激傳遞至細胞內，參與細胞的生長、發育、分化等一系列生理活動，并在細胞的惡性轉化和腫瘤的發展中起重要作用[3]。

目前對于腫瘤組織中ERK和p38MAPK蛋白表達的研究結果尚存在爭議。Bang等[4]在胃癌組織中檢測到ERK蛋白表達增強；Price等[5]對神經膠質瘤和前列腺癌組織的研究則發現，腫瘤組織中ERK/p38MAPK蛋白表達未見明顯增加。韓艷春等[6]在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞中發現p-ERK和p-p38MAPK表達顯著升高，且兩者表達與腫瘤的預后顯著相關。趙凱等[7]研究發現人可溶性核因子κB受體活化因子配體（shRANKL）誘導MDA-MB-231細胞24 h后，細胞內ERK和p38MAPK蛋白表達均顯著增加。本實驗中發現，CCL22作用SBC-5細胞后，p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達明顯上升，U0126可顯著削弱CCL22引起的蛋白表達增加，由此推測CCL22誘導肺癌SBC-5細胞遷移和侵襲能力增加，可能是通過ERK磷酸化引起的。

綜上所述，本研究發現趨化因子CCL22對肺癌細胞有明顯的趨化作用，該作用可能是通過ERK磷酸化實現的，蛋白激酶抑制劑可顯著抑制肺癌細胞的遷移和侵襲，本研究結果可能會為肺癌轉移的治療提供新的實驗依據。

[1]Nakamura E S,Koizumi K,Kobayashi M,et al．RANKL-induced CCL22/macrophage-derived chemokine produced from osteoclasts potentially promotes the bone metastasis of lung cancer expressing its receptor CCR4[J]．Clin Exp Metastasis,2006,23(1): 9-18．

[2]Vander Griend D J,Rinker-Schaeffer C W．A new look at an old problem:the survival and organ-specific growth of metastases [J]．Sci STKE,2004,2004(216):3-9．

[3]Aisa Y,Miyakawa Y,Nakazato T,et al．Fucoidan induces apoptosis of human HS-sultan cells accompanied by activation of caspase-3and down-regulation of ERKpathways[J]．AmJHematol,2005,78(1):7-14．

[4]Bang Y J,Kwon J H,Kang S H,et al．Increased MAPK activity and MKP-1 overexpression in human gastric adenocarcinoma [J]．Biochem Biophys Res Commun,1998,250(1):43-47．

[5]Price D T,Della Rocca G,Guo C,et al．Activation of extracellular signal-regulated kinase in human prostate cancer[J]．J Urol,1999, 162(4):1537-1542．

[6]韓艷春,曾憲旭,王睿,等．p39MAPK信號通路與uPA在乳腺癌細胞及組織中表達的相關性[J]．癌癥,2007,26(1):48-53．

[7]趙凱,譚群亞,楊翀,等．干擾ERK/p-38 MAPK信號通路對乳腺癌骨轉移的影響[J]．中華實驗外科雜志,2011,28(2):311．

Express of ERK/p38MAPK protein in lung cancer cell migration and invasion induced by chemokine CCL22

Objective To investigate the express of ERK/p38MAPK proteins in lung cancer cell migration and invasion induced by chemokine CCL22．Methods Lung cancer SBC-5 cells were cultured with 100ng/ml CCL22(CCL22 group)or CCL22 and protein kinase inhibitor U0126(CCL22+U0126 group)．Cell migration and invasion was measured by Transwell method and scratch assay;the expression of p-ERK and p-p38MAPK in SBC-5 cells was determined by Western blot．Results The distances of cell migration in control,CCL22 and CCL22+U0126 groups were(112．6±27．2)μm,(351．9±16．4)μm and(145．1±29．6) μm,respectively(P＜0．05);the numbers of migrant cells in three groups were(199．2±32．8),(505．5±66．3)and(95．7±19．1),respectively(P＜0．05)．The expression of p-ERK and p-p38MAPK protein was significantly higher than that in control and CCL22+U0126 groups(P＜0．05)．Conclusion The expression of ERK/p38MAPK protein is up-regulated,indicating that ERK/ p38MAPK proteins may be involved in CCL22 induced lung cancer cell migration and invasion induced by chemokine CCL22．

Lung cancerChemokine CCL22 ERK P38MAPK Cancer migration

2014-06-11）

（本文編輯：胥昀）

杭州市醫藥衛生科技計劃資助項目（2011A046）；浙江省醫藥衛生科技計劃資助項目（2011KYA138）

310009 杭州市中醫院呼吸科（管彩虹、樓雅芳、朱黎紅、吳清）；杭州市紅十字會醫院普外科（趙凱）

趙凱，E-mail:zhaokaiguan@126.com