黃芪多糖對粒細胞減少期侵襲性肺曲霉病SD大鼠血清半乳甘露聚糖的影響

莊海峰 沈建平 莊曉芬 陳均法 鄭智茵

黃芪多糖對粒細胞減少期侵襲性肺曲霉病SD大鼠血清半乳甘露聚糖的影響

莊海峰 沈建平 莊曉芬 陳均法 鄭智茵

目的 觀察黃芪多糖（APS）與兩性霉素B（AmB）聯合應用對粒細胞減少期侵襲性肺曲霉病（IPA）大鼠血清半乳甘露聚糖（GM）值的影響，并探討其作用機制。方法 40只清潔級雄性SD大鼠，隨機分為5組，每組8只：（1）對照組：正常飼養；（2）模型組：建立IPA模型后正常飼養；（3）APS組：建模后腹腔注射APS 26．27mg（kg·d）×5d；（4）AmB組：建模后腹腔注射AmB 1．575mg（kg·d）×5d；（5）APS+AmB組：建模后分別予腹腔注射APS 26．27mg（kg·d）×5d+AmB 1．575mg（kg·d）×5d。（2）～（5）組大鼠經環磷酰胺（CTX）誘導、煙曲霉菌氣管內接種建立粒細胞減少期大鼠IPA模型，并于接種后連續腹腔注射給藥5d，第5天取大鼠動脈血以ELISA法檢測血清中GM值，并取胸腺稱重計算胸腺指數，根據統計分析結果評價APS對IPA模型大鼠胸腺指數和血清GM值的影響。結果 對照組胸腺指數高于其余4組，均有統計學差異（均P＜0．05）；APS組、APS+AmB組與模型組、AmB組比較胸腺指數升高，均有統計學差異（均P＜0．05）；模型組、APS組和APS+AmB組血清GM檢測敏感性均為87．5%，AmB組為75．0%，對照組為0．0%；模型組、APS組、AmB組和APS+AmB組血清GM值升高，與對照組比較均有統計學差異（均P＜0．05）；APS+AmB組與APS組、模型組比較，血清GM值減低，均有統計學差異（均P＜0．05）。結論 APS聯合AmB治療粒細胞減少期IPA大鼠能夠減輕病情，減低血清GM值，其機制可能與APS提高胸腺免疫功能，減少煙曲霉菌菌絲數量有關。

黃芪多糖 侵襲性肺曲霉病 半乳甘露聚糖

惡性血液病患者由于自身特點多伴有免疫功能缺陷，加之在治療過程中多種影響機體免疫功能藥物的使用，該類患者極易并發侵襲性真菌感染（IFI），IFI成為惡性血液病患者死亡的重要原因之一[1]。因此，研究惡性血液病患者并發IFI的發病特點有利于減少致病危險因素，合理使用免疫增強藥物，對降低IFI發病率、改善患者預后至關重要。侵襲性肺曲霉病（IPA）起病隱匿，預后差，患者病死率達56.0%～88.1%[2]。本研究應用環磷酰胺（CTX）誘導，煙曲霉菌氣管內接種建立粒細胞減少期SD大鼠IPA模型，采用黃芪多糖（APS）、兩性霉素B（AmB）單獨或聯合給藥，監測血清半乳甘露聚糖（GM）值，評價APS對IPA的預防及治療作用，從而預測APS對惡性血液病患者并發IPA的治療價值。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級7周齡雄性SD大鼠45只，體重180～220g，委托浙江中醫藥大學動物實驗中心購買及飼養。將大鼠以簡單隨機法分為5組，每組8只，余下5只作為實驗過程中死亡大鼠的補充。分組如下：（1）對照組：正常飼養，不建模，不給藥；（2）模型組：建模后正常飼養，實驗過程中死亡1只，予以補充；（3）APS組：建模后腹腔注射APS共5d，實驗過程中死亡1只，予以補充；（4）AmB組：建模后腹腔注射AmB共5d，實驗過程中死亡1只，予以補充；（5）APS+AmB組：建模后分別腹腔注射APS和AmB共5d，實驗過程中死亡2只，予以補充。

所有實驗動物均采用腹腔注射的給藥方式，給藥量經動物與人用藥量換算表計算得出，計算公式為Aj= Kij×Ai（Aj為大鼠單位體重給藥量，Ai為人單位體重給藥量，最新人與大鼠間相交系數Kij=6.3），計算時大鼠體重以0.2kg，人體重以60kg為標準。由此計算得出，APS劑量（按照臨床上用藥劑量250mg/d計算）約為26.27mg/ kg，國產AmB劑量（按照臨床上一般從15～20mg/d起始給藥，因其給藥特殊性故僅以初始劑量15mg/d計算）約為1.575mg/kg。

1.2 主要藥物和試劑 CTX注射液（200mg/支）購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；APS粉針劑（250mg/支）購于江蘇健佳生物制藥有限公司；AmB粉針劑（25mg/支）為華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司產品；煙曲霉菌株（編號CCCCMIDA1）購自南京中國真菌菌種保藏中心；水合氯醛（分析純，純度＞99.5%）為國藥集團化學試劑有限公司產品。TUNEL試劑盒購于美國羅氏公司。

1.3 IPA大鼠模型建立與鑒定

1.3.1 粒細胞減少大鼠模型建立 參考相關文獻[3]，所有實驗動物于煙曲霉菌懸液接種前5d腹腔注射CTX 75mg/kg，之后每隔4d注射1次60mg/kg CTX，直至處死。1.3.2 煙曲霉孢子懸液的制備和接種 煙曲霉菌株轉種于斜面培養基上，35℃培養5d形成大量煙曲霉菌孢子，分生孢子收集于含有0.1%吐溫80的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，制成煙曲霉菌分生孢子菌液，通過8層無菌粗紗過濾去除菌絲，將過濾后的孢子懸液用含有0.1%吐溫80的PBS清洗2次，在光學顯微鏡下計數，調整孢子懸液濃度為1×109cfu/L，4℃儲存（1個月內備用），使用前震蕩均勻。紫外線滅菌手術室內，予10.0%水合氯醛溶液（劑量3ml/kg）麻醉動物，麻醉后固定大鼠，頸前氣管外備皮及消毒后暴露氣管，氣管內注射煙曲霉菌孢子懸液0.3ml，注射后消毒縫合創口，見圖1。

圖1 IPA大鼠模型建立操作過程（A：實驗大鼠接種煙曲霉菌準備；B：暴露氣管；C：氣管內注射煙曲霉菌懸液；D：注射菌液后75°傾斜放置3min，保證菌液進入肺內；E：術后縫合消毒）

1.3.3 模型鑒定

1.3.3.1 血白細胞計數 預實驗期間于第2次注射CTX當天大鼠眼眶取血300～500μl手工計數白細胞，以白細胞低于1 000個/μl為符合實驗要求。SD大鼠血常規血白細胞總數（5.0～25.0）×106/μl，中性粒細胞比例9.0%～34.0%，中性粒細胞絕對數（1.1～6.0）×106/μl。

1.3.3.2 組織病理學檢查 接種后第4天處死動物，取大鼠肺部組織HE染色后鏡下觀察，提示存在曲霉菌感染改變，見圖2。

1.4 胸腺指數計算 電子天平稱量大鼠體重，以10.0%水合氯醛麻醉，劑量3ml/kg，解剖后完整分離胸腺并精密天平稱重，計算胸腺指數。胸腺指數=胸腺重量（mg）/大鼠體重（g）。

圖2 IPA大鼠肺組織病理學檢查（A：大鼠肺內小血管腔內可見大量煙曲霉菌菌絲；B：肺內充血、出血明顯；C～D：支氣管內可見較多菌絲，可見炎性浸潤、肺泡上皮增生；E～F：支氣管腔內可見較多菌絲，部分浸潤支氣管及小血管壁；HE染色，×400）

1.5 胸腺細胞凋亡指數（AI）計算 采用TUNEL染色法，結合凋亡細胞形態特征綜合判斷，細胞核中出現棕色顆粒為TUNEL陽性細胞，即凋亡細胞。選擇陽性細胞區，400倍目鏡下分別計數D16目鏡微網網格中陽性細胞數和細胞總數，每例計數10網格，重復3次取平均值，計算AI。AI=TUNEL陽性細胞數/細胞總數×100%。1.6 ELISA法檢測血清GM值 參考文獻[4-5]，每次實驗均以標準血清吸光值均值為0.3～0.8、陽性對照吸光值/標準吸光值均值＞1.5、陰性對照吸光值/標準吸光值均值＜0.5作為實驗內質控。被檢大鼠血清的GM值=被檢血清吸光值/標準血清吸光值，GM值＜1為陰性，1＜GM值≤1.5為可疑陽性，GM值＞1.5為陽性。

1.7 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 各組大鼠建模后均出現發熱，肛溫37.5～38.8℃，均有不同程度的精神萎靡，活動量減少，體重減輕，皮毛無光澤，同時嚴重脫毛。大部分大鼠眼眶有滲血后結痂，部分存在腹部皮毛潮濕、小便異常、大便稀爛等情況。治療過程中APS組、APS+ AmB組大鼠較模型組、AmB組大鼠精神、活動量、皮毛等一般狀況方面有所好轉。

2.2 各組大鼠胸腺指數比較 APS組、APS+AmB組、模型組和AmB組胸腺指數低于對照組，均有統計學差異（均P＜0.05）；而APS組、APS+AmB組與模型組、AmB組比較胸腺指數升高，均有統計學差異（均P＜0.05）；但模型組和AmB組間、APS組和APS+AmB組間均無統計學差異（均P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠胸腺指數比較（mg/g）

2.3 各組大鼠胸腺細胞凋亡情況比較 APS組、APS+ AmB組、模型組和AmB組胸腺細胞AI結果均高于對照組（均P＜0.05）；進一步比較發現，APS組、APS+AmB組和AmB組AI均低于模型組，其中APS組、APS+AmB組與模型組比較均有統計學差異（均P＜0.05），而AmB組與模型組間、APS組和APS+AmB組間均無統計學差異（均P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠胸腺細胞AI比較（%）

2.4 各組大鼠血清GM值比較 APS組、APS+AmB組、模型組和AmB組GM值均高于對照組（均P＜0.05）；而APS組、APS+AmB組和AmB組均低于模型組，其中APS+AmB組與模型組比較有統計學差異（P＜0.05），而APS組和AmB組與模型組比較均無統計學差異（均P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清GM值比較

3 討論

目前APS已經在臨床上廣泛應用于免疫缺陷的患者，對其免疫增強作用及機制的研究已經較為深入和廣泛，但對免疫功能缺陷后繼發感染性疾病的患者，應用APS的價值卻少見于報道。因此本研究建立了粒細胞減少期IPA大鼠模型，應用APS和AmB兩藥單獨及聯合治療，通過對IPA診斷特異性較高，而且具有療效監測作用的GM值檢測來評價APS對IPA大鼠的治療作用，并探討其可能機制。

免疫器官重量檢測是檢測免疫功能的一個簡單可行的指標。免疫增強劑可使免疫器官胸腺、脾臟等重量增加。胸腺、脾臟為動物體內的主要免疫器官，胸腺、脾臟指數是反映這兩個重要免疫器官免疫功能的重要指標之一，其數值高低的變化可以反映機體免疫功能的狀態[6-7]。從胸腺指數和胸腺細胞凋亡實驗來看，與對照組大鼠比較，模型組、APS組、AmB組、APS+AmB組的胸腺指數均有不同程度的減低，說明免疫抑制導致實驗大鼠胸腺萎縮，胸腺細胞大量凋亡；而APS組、APS+ AmB組大鼠分別與模型組、AmB組大鼠比較，胸腺指數均增加，同時APS組、APS+AmB組大鼠胸腺細胞AI較模型組明顯減少，說明APS能夠增加IPA大鼠的胸腺重量，減少胸腺細胞凋亡，提高胸腺免疫功能，從而對減輕CTX誘導的免疫抑制作用，其應用具有一定的積極意義。

血清GM值檢測對于IPA診斷特異性較高，且能夠用于療效判斷。GM值會隨著IPA的進展而升高，也會隨著抗真菌治療而降低。本研究結果提示模型組、APS組和APS+AmB組大鼠血清GM檢測敏感性均為87.5%，AmB組為75.0%，對照組為0.0%。與對照組相比，模型組、APS組、AmB組、APS+AmB組大鼠血清中GM值均明顯升高，說明其余4組大鼠成功感染煙曲霉菌，IPA模型建立成功。APS+AmB組與模型組大鼠相比血清中GM值有所減低，說明APS+AmB對IPA大鼠存在治療作用；而APS+AmB組血清GM值與AmB及APS組相比雖無統計學差異，但也有明顯降低，體現出聯合用藥的效果一定程度上優于單藥。雖然與AmB相比，APS單藥抗真菌治療作用不明顯，但APS組大鼠GM值也低于模型組，說明APS單藥使用也有一定的治療作用。結合APS對IPA大鼠胸腺免疫功能的影響，考慮APS的作用機制可能是通過影響IPA大鼠的胸腺免疫功能，間接減少煙曲霉菌菌絲數量，使煙曲霉釋放入血清中減少，從而降低了GM值，達到了治療的目的。

綜上所述，APS聯合AmB治療可以改善IPA大鼠的一般狀況，降低血清GM值，其機制可能與APS提高胸腺免疫功能，減少煙曲霉菌菌絲數量有關。但本研究目前尚在動物實驗階段，臨床推廣使用尚需進一步更深入的研究。

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[2]Williamson E C,Leeming J P,Palmer H M,et al．Diagnosis of invasive aspergillosis in bone marrow transplant recipients by polymerase chain reaction[J]．Br J Haematol,2000,108(1):132-139．

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[4]楊燕萍,胡作為,胡冬根,等．黃芪多糖對小鼠胸腺細胞凋亡的調節作用[J]．中華微生物學和免疫學雜志,2001,21(6):589．

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Effect of astragalus polysacharin and amphotericin B treatment on serum galactaomannan levels in invasive pulmonary aspergillosis rats with granulocytopenia

Objective To investigate the effect of astragalus polysacharin(APS)and amphotericin B(AmB)treatment on serum galactaomannan(GM)levels in invasive pulmonary aspergillosis(IPA)rats with granulocytopenia．Methods Forty male Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into five groups:control group,model group,APS group(intraperitoneal injection of APS 26．27mg/kg·d),AmB group (intraperinoneal injection of AmB 1．575mg/kg·d)and APS+AmB group(intraperitoneal injection of APS 26．27mg/kg·d and AmB 1．575mg/kg·d)．The IPA model was established by intratracheal inoculation of aspergillus fumigatus after cyclophosphamide(CTX)induction in rats of groups 2,3,4 and 5．After 5 d of drug administration the arterial blood and thymus of rats were collected．The body and thymus were weighted and the thymus index was calculated; serum GM levels were measured by ELISA method．Results The thymus index in APS group and APS+AmB group was higher than that of AmB group and model group(P＜0．05)．Serum GM levels in model group,APS group,AmB group and APS+AmB group were higher than that in control group(P＜0．05);and the serum GM level in APS+AmB group was lower than that in model group and APS group(P＜0．05)．Conclusion The combination of APS and AmB can alleviate the disease extent and decrease serum GM level in rats with invasive pulmonary aspergillosis after granulocytopenia;which may be associated with the improvement of immune function of thymus．

Astragalus Polysacharin Invasive pulmonary aspergillosis Galactaomannan

2014-07-03）

（本文編輯：胥昀）

浙江中醫藥大學科研基金重點項目（201101）

310006 杭州，浙江中醫藥大學附屬第一醫院血液科

鄭智茵，E-mail：z05z01y08@aliyun.com