HIF-1α基因多態性與大動脈粥樣硬化型腦梗死的相關性研究

陳捷 林蕾

HIF-1α基因多態性與大動脈粥樣硬化型腦梗死的相關性研究

陳捷 林蕾

目的 探討HIF-1α（rs11549467）基因多態性與大動脈粥樣硬化（LAA）型腦梗死間的相關性。方法 將125例LAA型腦梗死患者（腦梗死組）和180例健康體檢者（對照組）作為研究對象，利用聚合酶鏈限制性長度多態性分析（PCR-RFLP）及基因測序檢測HIF-1α（rs11549467）基因的多態性。 結果 腦梗死組和對照組間基因型頻率有統計學差異（χ2=6．55，P= 0．04），GG基因型為腦梗死發病的危險因素（OR=1．96，95%CI=1．17～3．29，χ2=6．54，P=0．01），GA基因型為腦梗死發病的保護因素（OR=0．53，95%CI=0．31～0．89，χ2=5．72，P=0．02）。logistic回歸分析提示GG基因型（OR=2．53，95%CI=1．03～17．03，P=0．03）、吸煙史（OR=2．02，95%CI=1．18～3．47，P=0．01）、高血壓病史（OR=2．28，95%CI=1．35～3．85，P=0．00）均為危險因素，踝臂指數（OR=0．32，95%CI=0．21～0．89，P=0．01）為保護因素。結論 HIF-1α（rs11549467）基因多態性與LAA型腦梗死發生具有相關性。

HIF-1α 腦梗死 多態性 單核苷酸

腦卒中是目前導致人類死亡的三大主要疾病之一，缺血性腦卒中是其中最常見的類型，發病率占所有腦卒中的87%，在我國腦卒中患者中的比例約為60%～80%[1]。缺血性腦卒中發病機制復雜，是一種復雜的多因素疾病。環境因素、遺傳因素、動脈粥樣硬化、高血壓、高血脂、糖尿病等均是缺血性腦卒中的高危因素，其中大動脈粥樣硬化（large artery atherosclerotic，LAA）型腦梗死具有明顯的家族遺傳傾向。近年來缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）已成為許多疾病的重要候選基因[2]，rs11549467（G1790A）是該基因的常見單核苷酸多態性位點，但該基因與腦梗死的相關性研究尚未見于報道。本研究探討了浙江省臺州地區人群HIF-1α基因多態性與LAA型腦梗死易感性之間的關系，分析腦梗死的危險因素及其作用機制，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇本院2011-01—2014-03門診及住院腦梗死患者共125例為腦梗死組，均符合1995年全國第四次腦血管病學術會議制定的腦梗死標準[3]，并經頭部CT和（或）MRI檢查確診，根據類肝素藥物治療急性缺血性腦卒中試驗（trail of org 10172 in acute stroke treatment，TOAST）病因分型選取LAA型腦梗死病例。納入標準：全部患者均經顱腦CT和（或）MRI確診腦梗死，并行經顱多普勒（TCD）或顱腦彩超、顱腦磁共振血管造影（MRA）、CT血管造影（CTA）或數字減影血管造影（DSA）、心臟超聲等檢查明確腦血管和心臟病變情況。排除標準：（1）心源性栓塞；（2）其他病因或不明原因型卒中；（3）嚴重心臟疾病，近期發生心肌梗死或心絞痛疾??；（4）嚴重感染；（5）嚴重肝、腎功能不全；（6）血栓性疾??；（7）腫瘤。

180例對照組為同期在我院健康體檢者，既往無卒中病史，顱腦CT或MRI證實無腦梗死病灶，TCD、顱腦MRA或CTA等檢查證實無腦血管病變。并排除冠心病、腦血管病家族史、1型糖尿病、肝腎疾病、血液系統疾病、自身免疫性疾病及妊娠者。

1.2 臨床資料獲取 兩組研究對象均為浙江地區漢族人，均為無血緣關系的散發人群，記錄以下指標：年齡、性別、吸煙史、高血壓病史、糖尿病病史、LDL、踝臂指數、同型半胱氨酸（HCY）、頸動脈彩色多普勒檢查結果。本研究得到醫院倫理委員會批準，所有研究對象均充分了解研究方案并簽署知情同意書，所有標本的收集均經受試者本人或家屬同意。

1.3 HIF-1α基因型檢測

1.3.1 DNA提取 所有受檢者均晨起抽取靜脈血3ml，采用DNA試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）提取人類白細胞基因組DNA。將提取好的DNA置于-20℃冰箱保存備用。

1.3.2 引物設計與合成[4]引物由上海華舜生物工程有限公司合成，上游引物：5＇-TGT GGC CAT TGT AAA AAC TCA-3＇，下游引物：5＇-TTT AAT TCA TCA GTG GTG GCA-3＇。

1.3.3 基因多態性的檢測 用聚合酶鏈限制性長度多態性分析（PCR-RFLP）技術檢測HIF-1α基因多態性。PCR反應體系總體積為20μl，其中內含100ng基因組DNA，Taq酶PCR混合試劑15μl，上下游引物（10pmol/ L）各0.5μl，最后補充去離子水至終體積20μl。PCR反應條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，58℃退火及復性1min，共35個循環，末次延伸72℃5min。PCR產物進行AciⅠ酶酶切，3%瓊脂糖凝膠電泳分離，在電泳圖譜上鑒定不同的基因型。即GG基因型（終產物為114bp和143bp的兩條帶），GA基因型（終產物為114bp、143bp、255bp的三條帶），AA基因型（終產物為255bp的一條帶）。并隨機抽取10%樣本進行重復基因測序，基因測序不同基因型見圖1-3。

圖1 SNP rs11549467測序GG基因型

圖2 SNP rs11549467測序GA基因型

圖3 SNP rs11549467測序AA基因型

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，分析等位基因和基因型頻率與腦梗死的相關性。計量資料以表示，兩組間均數的比較采用t檢驗?；蛐图暗任换蝾l率的比較行χ2檢驗。經Hardy-Weinberg平衡檢驗確認樣本的群體代表性。采用二分類非條件logistic回歸分析HIF-1α（rs11549467）基因多態性與LAA型腦梗死發病的關系。

2 結果

2.1 兩組受試者臨床指標比較 結果顯示兩組受試者年齡、性別、糖尿病病史比較均無統計學差異（均P＞0.05）。腦梗死組吸煙史，高血壓病史，頸動脈粥樣硬化發生率、HCY、LDL含量均高于對照組，踝臂指數低于對照組，均有統計學差異（P＜0.05或0.01），見表1。

表1 兩組受試者臨床指標比較

2.2 兩組受試者HIF-1α（rs11549467）基因多態性比較兩組受試者間HIF-1α（rs11549467）基因型頻率和等位基因頻率分別比較，基因型頻率有統計學差異（χ2=6.55，P=0.04）；腦梗死組和對照組G型等位基因頻率分別為88%和81%，比較有統計學差異（χ2=5.96，P=0.02）。進一步結果顯示，GG基因型為腦梗死發病的危險因素（P=0.01），GA基因型為腦梗死發病的保護因素（P=0.02），見表2。

表2 兩組受試者HIF-1α基因多態性比較

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗 兩組受試者HIF-1α（rs11549467）基因多態性Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，腦梗死組χ2=0.03，P=0.87，對照組χ2=0.74，P= 0.39，可以認為兩組趨向于遺傳平衡，見表3。

表3 兩組受試者HIF-1α基因多態性Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.4 腦梗死發病危險因素分析 將單因素分析篩選出的可能危險因素進行多因素logistic回歸分析，最終進入模型的因素有：GG基因型（P=0.03）、吸煙史（P=0.01）、高血壓病史（P=0.00）為危險因素，踝臂指數（P=0.01）為保護因素，見表4。

3 討論

HIF-1α是機體細胞在低氧環境中產生的一種轉錄因子[5]，參與血管生成、紅細胞生成、葡萄糖、鐵、能量代謝和酸堿平衡調節和血管舒縮等重要生物學進程，在腦梗死的發生和發展中起到重要作用。近年來關于HIF-lα基因多態性與許多疾病如急性心肌梗死、糖尿病、癌癥等的相關性研究取得了一系列進展[2]，rs11549467（G1790A）是HIF-1α基因的常見單核苷酸多態性位點。

表4 腦梗死易感基因多態性的logistic回歸分析

本研究結果發現，腦梗死組HIF-1α（rs11549467）G型等位基因頻率明顯高于對照組，說明該位點G型等位基因可能增加LAA型腦梗死發病風險。進一步分析基因型頻率發現，腦梗死組GG基因型頻率明顯高于對照組，提示該基因型可能增加LAA型腦梗死發病風險；而GA基因型頻率明顯低于對照組，提示該基因型可能減少LAA型腦梗死發病風險。logistic回歸分析提示，GG基因型為LAA型腦梗死的危險因素，由此可得出結論，HIF-1α（rs11549467）基因多態性與LAA型腦梗死易感性具有一定的相關性。

多因素回歸分析提示，除了GG基因型外，吸煙史、高血壓病史也是LAA型腦梗死的危險因素，而踝臂指數為保護因素。吸煙史與高血壓已成為公認的腦梗死危險因素，而目前踝臂指數已經作為動脈粥樣硬化的一種無創測量手段正受到越來越多的關注[6]。當踝臂指數降低時，說明周圍血管的狹窄程度由于斑塊及動脈粥樣硬化等原因而增加，從而使血流速度減慢，血流量下降，而且大中型血管的病變也與之類似，如腦血管大動脈粥樣硬化的改變可導致缺血性腦卒中、短暫性腦缺血發作等血管事件的發生。

傅志超等[7]報道，HIF-1α（rs11549467）基因多態性與鼻咽部腫瘤灶的放射敏感性相關，從而影響鼻咽癌的局部療效。傅志超等[7]及Ollerenshaw等[8]研究均發現，rs11549467的單核苷酸替換導致HIF-1α蛋白質序列中588位的丙氨酸被羥丁氨酸替代，從而影響402位和564位的脯氨酸羥化。在低氧狀態下，GA基因型的基因轉錄活性較GG型高，從而發揮更高的氧穩態作用，本研究結果與上述研究結果類似。眾所周知，多因素所致的動脈粥樣硬化是LAA型腦梗死的先決條件，動脈粥樣硬化的進展與血管腔缺血缺氧有關，當缺氧時多種血管生成因子的表達，促進血管壁內的微血管大量生成，從而使血管腔進一步狹窄。故推測在低氧狀態下，GA基因型轉錄活性較GG型高，在缺血缺氧及再灌注等條件下具有保護血管內皮細胞功能，減少內皮細胞凋亡等作用。

本研究通過比較LAA型腦梗死患者與正常對照者的HIF-1α（rs11549467）基因多態性，結果提示HIF-1α（rs11549467）基因多態性與LAA型腦梗死發生存在一定的相關性。但本研究仍存在一些局限性，如樣本量仍偏小，兩組受試者的其他生活習慣及環境因素控制欠佳等。進一步研究除了擴大樣本量外，還應具體探討HIF-1α（rs11549467）基因多態性與LAA型腦梗死發生機制。

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[2]Kim H O,Jo Y H,Lee J,et al．The C1772T genetic polymorphism in human HIF-1alpha gene associates with expression of HIF-1alphaproteinin breastcancer[J]．OncolRep,2008,20(5):1181-1187．

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Association between HIF-1α gene polymorphisms and large artery atherosclerotic cerebral infarction

Objective To investigate the association of HIF-1α gene(rs11549467)polymorphisms with large artery atherosclerotic(LAA)cerebral infarction．Methods One hundred and twenty five patients with LAA cerebral infarction and 180 healthy controls were included in the study．The polymorphisms of HIF-1α gene(rs11549467)was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)method and sequence-based genotyping．Results The HIF-1α gene(rs11549467)polymorphisms were significantly associated with LAA cerebral infarction(χ2=6．55,P=0．04)．The individuals with GG genotype showed statistically significant increased risk for LAA cerebral infarction(OR=1．96,95%CI=1．17～3．29;χ2=6．54;P=0．01);whereas the individuals with GA genotype showed protection against LAA cerebral infarction．(OR=0．53, 95%CI=0．31～0．89;χ2=5．72;P=0．02)．Logistic regression analysis showed that the GG genotype(OR=2．53,95%CI=1．03～17．03; P=0．03),smoke(OR=2．02,95%CI=1．18～3．47;P=0．01)and hypertension(OR=2．28,95%CI=1．35～3．85;P=0．00)were risk factors for LAA cerebral infarction;whereas ankle brachial index(OR=0．32,95%CI=0．21～0．89;P=0．01)was a protection factor．Conclusion The rs11549467 variant of HIF-1α gene may be a genetic risk factor for developing large artery atherosclerotic cerebral infarction．

Hypoxia-inducible factor-1α Cerebral infarction Polymorphism Single nucleotide

2014-06-09）

（本文編輯：胥昀）

318020 臺州市第一人民醫院神經內科通信作者：林蕾，E-mail：21313102@qq.com