放射性腦損傷模型大鼠腦內移植超順磁性氧化鐵標記神經干細胞MRI示蹤研究

周賢斌 丁維軍 于長輝 雷皓 汪洋

放射性腦損傷模型大鼠腦內移植超順磁性氧化鐵標記神經干細胞MRI示蹤研究

周賢斌 丁維軍 于長輝 雷皓 汪洋

目的 探討超順磁性氧化鐵顆粒標記的神經干細胞（NSC）在放射性腦損傷大鼠模型腦內移植后，磁共振成像（MRI）示蹤觀察的可行性。方法 建立放射性腦損傷模型大鼠16只，4周后將磁化標記的NSC立體定向植入模型大鼠海馬區。移植后1、2、4、8周行4．7T MRI干細胞示蹤觀察，選擇T1WI、T2WI和梯度回波（GRE）序列。移植后1、8周處死大鼠，取腦組織冰凍切片后進行普魯士藍染色。結果 移植后MRI顯示大鼠注射點處可見類圓形低信號影；GRE序列顯示標記細胞較清晰，而T2WI顯示大鼠腦正常結構較清晰。移植后1、8周移植部位普魯士藍染色可見陽性細胞，與MRI結果相符。結論 MRI能夠在放射性腦損傷大鼠腦內活體連續示蹤觀察NSC的遷移及分布情況。

超順磁性氧化鐵 磁共振成像 干細胞 放射性腦損傷 大鼠

近年來，應用神經干細胞（NSC）移植治療腦疾病的研究不斷深入，但對于移植后神經再生的鑒定仍然以免疫組織化學方法為主，而在臨床及科研工作中，需要一種無創的方法來觀察NSC移植后存活、遷移及功能性分化的情況。本實驗以超順磁性氧化鐵（SPIO）納米粒子作為磁性分子探針，體外標記NSC，在放射性腦損傷大鼠腦模型腦內移植后，利用高場強磁共振成像（MRI）對標記細胞進行示蹤研究[1]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物NSC的分離培養 孕14～16d的SPF級SD大鼠購自浙江醫學科學院實驗動物中心，以1.0%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔麻醉處死后，75.0%乙醇消毒腹部皮膚，取出胚胎，解剖顯微鏡下取中腦腹側約110mm×115mm×110mm組織塊，將組織塊反復吹打成單細胞懸液，200目濾網過濾，1 500r/min離心10min，棄上清液，加入含1.0%細胞培養添加劑N2、2.0%無血清細胞培養添加劑B27和20ng/ml人堿性成纖維生長因子（hbFGF）的DMEM/F12培養液（美國Gibco公司產品），調整細胞數后以5×106/ml接種于新的培養瓶，于37℃、5.0%CO2懸浮培養，每2～3d半量換液1次，每5～7d機械消化分離克隆傳代1次。NSC的鑒定采用Nestin（美國BD Pharmingen公司產品）間接免疫熒光化學染色法[2]。

1.2 NSC的SPIO磁化標記 將SPIO（美國Advanced maganetic公司產品）和轉染介質TA共孵育1h，制成SPIO-TA復合物。在NSC培養液中加入50μg/ml的Feridex（美國Advanced maganetic公司產品，內含Fe 11.2mg/ml），調節終濃度至25μg/ml，將陽離子脂質體Lipofectamine（美國Invitrogen公司產品）以1∶625體積比加入，并混合30min。將NSC上清液離心棄去，以SPIO-TA復合物重懸，在37℃、5.0%CO2條件下培養1～2h，收集NSC，500r/min離心3min，棄上清液后加入新鮮的NSC培養液。

1.3 SPIO標記NSC的普魯士藍染色[3]以多聚賴氨酸（50μg/ml）預先處理24孔培養板，將SPIO標記的NSC克隆球種植，7d后棄去培養液，以PBS洗滌2次，4.0%多聚甲醛固定30min，蒸餾水反復洗滌3次；Perl反應液作用30min，蒸餾水洗滌3次，1.0%核固紅復染，再以蒸餾水反復沖洗，顯微鏡下拍照。

1.4 放射性腦損傷大鼠模型建立[4]及大鼠NSC移植 SPF級健康雌性SD大鼠16只，體重180～220g，平均（200±20）g，由浙江醫學科學院實驗動物中心提供（實驗動物合格證號：SCXK浙2008-0033）。大鼠經3.6%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉后，俯臥于西門子加速器床板（西門子KD2型），應用加速器產生的6MV-X線（劑量率200～210cGy/min），源皮距SSD 100cm，單次全腦照射，照射野3cm×2cm，光野上界位于雙眼后眥連線，下界位于雙耳后連線，左右露空，以1cm厚的組織補償物覆蓋照射野。鉛塊屏蔽雙眼、頸部、胸腹部，參考深度為1.5cm，照射總劑量20Gy。

磁化標記的NSC移植至放射性腦損傷大鼠右側海馬。NSC移植前用PBS重懸，細胞濃度調整為1×107/μl。腦損傷大鼠經1.0%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉后固定于立體定向儀，移植靶點為AP：0.6mm，L：3.0mm，V：4.0mm。各靶點用微量注射器勻速緩慢注入3μl，5min內完成，留針5min后緩慢拔針，然后縫合頭皮切口，回籠飼養。

1.5 MRI動態觀察移植后大鼠體內SPIO標記NSC NSC移植后1、2、4、8周進行MRI動態觀察。MRI檢測在配備有直徑為20cm梯度線圈的4.7 T BIOSPEC 47/30cm動物成像儀上完成（德國Bruker公司產品）。成像實驗用直徑為12cm的Helm-holtz體線圈激發，直徑為2.5cm的表面線圈接收。成像條件：采用頭顱線圈，窗寬（FOV）=3.5cm×3.5cm，層厚0.8mm，層間距1.6mm。分別進行T1自旋回波（SE），T2快速自旋回波（FSE），T2梯度回波（GRE）序列掃描。

1.6 移植后大鼠海馬區腦組織鐵染色 NSC移植后1、8周進行大鼠動脈灌注固定取大腦標本。具體步驟如下：大鼠行1.0%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔深度麻醉，開胸穿刺入升主動脈，0.9%氯化鈉注射液250ml灌注，再用4.0%多聚甲醛灌注，固定約30min。切取自視交叉至其后3mm的腦組織，再以4.0%多聚甲醛固定4h。固定后PBS清洗30min，10.0%蔗糖浸泡2h，20.0%蔗糖浸泡4h，30.0%蔗糖4℃下浸泡過夜。將腦組織塊置于冰凍包埋液，-20℃冰箱內冰凍，切片后行鐵染色。先以免疫組織化學ABC法染色了解移植細胞在大鼠腦內的分化和存活情況；后行普魯士藍染色30min，倒置相差顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 大鼠NSC培養與鑒定 孕14～16d的胚胎SD大鼠中腦腹側細胞經懸浮培養3～5d后，于倒置相差顯微鏡下觀察，部分細胞形成克隆球，見圖1A?？筃estin免疫熒光染色后于熒光顯微鏡下觀察，間接免疫熒光化學染色陽性，見圖1B。

圖1 大鼠NSC培養與鑒定（A：NSC克隆球，×40；B：熒光顯微鏡下觀察呈Nestin陽性，抗Nestin免疫熒光染色，×100）

2.2 SPIO標記的NSC腦內移植后的MRI觀察[5]由于其特殊的化學結構，SPIO具有超順磁性。SPIO分布于細胞后，使組織信號降低，在T2像上產生低信號改變。磁化NSC大鼠腦內移植后1周，行T1（SE）、T2（FSE）、T2（GRE）掃描在移植區內可見低信號區，見圖2。隨著時間延長，到移植后8周T2（GRE）掃描提示移植區低信號區域逐漸有變大的趨勢，移植區信號變為混雜。2.3 移植后大鼠腦組織切片普魯士藍染色 鏡下可見，普魯士藍染色陽性的細胞團所在部位與MRI成像中的低信號區相一致，見圖3。

圖2 移植后大鼠海馬區T2（GRE）掃描

圖3 移植后大鼠腦組織切片中NSC鐵染色（普魯士藍染色，×100）

3 討論

近年來，在動物模型中應用NSC移植治療腦創傷、缺血性腦損傷及神經退行性疾病的研究取得了顯著成就?；铙w評價移植后NSC在腦損傷模型宿主腦內的遷移和分布已獲得了突破性的進展，為NSC移植的應用奠定了堅實的基礎，而在放射性腦損傷方面的應用則尚未見相關報道。

如何對移植入體內的NSC的存活、遷移、分化進行觀察，一直是NSC領域研究的熱點及難點問題，目前的一個研究熱點是利用非侵入性納米分子影像學技術監測、追蹤細胞在體內的活動狀況[6]。有研究報道利用脂質體轉染SPIO標記、同時攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的胚胎干細胞[7]，SPIO能夠增強質子弛豫，即使在較弱的磁場中也可產生較大的磁性，而外磁場撤除后磁性也迅速消失。SPIO分布于組織后，造成局部磁場的不均勻，從而加速了質子去位相的T2弛豫。本研究證實，用SPIO標記NSC后移植，通過MRI技術可以在活體上追蹤這些標記細胞的存活、遷移情況，可在移植后對NSC進行準確的組織學分布示蹤。同時有研究表明SPIO對NSC的生長和增殖沒有明顯影響，轉染了SPIO的NSC可以正常地分化為神經細胞[8]。SPIO標記非常有利于臨床上NSC移植后的在體細胞示蹤，通過MRI能對其在宿主體內的遷移、分布和生存情況進行實時監測。

SPIO標記的NSC植入放射性腦損傷大鼠腦內后，本研究發現在T1（SE）、T2（FSE）、T2（GRE）掃描序列中，T2（GRE）序列上出現較明顯的低信號區，這表明GRE是顯示SPIO標記的一種敏感掃描序列。移植后8周，T2（FSE）、T2（GRE）掃描仍可觀察到移植區明顯的低信號，但低信號逐漸減弱，同時在T2（GRE）成像上移植區低信號區域逐漸有變大的趨勢，伴隨出現高信號，移植區信號變為混雜。筆者認為，在MRI上信號逐漸減弱甚至出現高信號，是由于移植區內的細胞內鐵含量下降導致?？傊?，通過MRI觀察SPIO標記的細胞能夠為移植細胞的在體檢測提供了可靠的方法。

本研究表明，SPIO顆粒可以在體外標記胎鼠的NSC，利用MRI能夠連續示蹤觀察其在放射性腦損傷大鼠腦組織內的分布和遷移情況，大鼠腦組織的體外研究證實了MRI的結果。

[1]金莉蓉,洪霞,鐘春玖,等．超順磁氧化鐵標記骨髓基質干細胞移植治療帕金森病鼠的實驗研究[J]．中國臨床神經科學,2006,14(4):348-353．

[2]夏鷹,江澄川,楊林,等．超順磁氧化鐵標記神經干細胞移植治療帕金森病大鼠模型的研究[J]．中華醫學雜志,2006,86(17):1207-1210．

[3]Neri M,Maderna C,Cavazzin C,et al．Efficient in vitro labeling of human neural precursor cells with superparamagnetic iron oxide particles:relevance for in vivo cell tracking[J]．Stem Cells,2008, 26(2):505-516．

[4]Liu Y,Xiao S,Liu J,et al．An experimental study of acute radiation-induced cognitive dysfunction in a young rat model[J]．AJNR Am J Neuroradiol,2010,31(2):383-387．

[5]Frank J A,Miller B R,Arbab A S,et al．Clinically applicable labeling of mammalian and stem cells by combining superparamagnetic iron oxides and transfection agents[J]．Radiology,2003,228(2): 480-487．

[6]Bulte J W,Duncan I D,Frank J A．In vivo magnetic resonance tracking of magnetically labeled cells after transplantation[J]．J Cereb Blood Flow Metab,2002,22(8):899-907．

[7]Hoehn M,Küstermann E,Blunk J,et al．Monitoring of implanted stem cell migration in vivo:a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat[J]．Proc Natl Acada Sci U S A,2002,99(25):16267-16272．

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Magnetic resonance tracking of transplanted neural stem cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles in rats with wholebrain irradiation

Objective To explore the feasibility of labeling neural stem cells(NSCs)with superparamagnetic iron oxide (SPIO)particles in tracking the labeled cells after transplantation into rats with whole brain irradiation．Methods Irradiation injury was induced in 16 female Sprague-Dawley rats by whole brain irradiation．Four weeks after irradiation neural stem cells derived from the brain of 14-d embryonic rats and co-labeled with SPIO and poly-L-lysine were transplanted in the brain of irradiated rats．4．7T MRI scanning was performed to monitor the transplanted cells after 1,2,4,8 weeks．Two rats were sacrificed at week 1 and 8 after transplantation and Prussian blue staining on the brain sections performed．Results The areas with transplanted labeled neural stem cells were presented as hypointense zone on MR images．Prussian blue staining showed labeled cells in the transplanted hippocampus area．Conclusion MRI as a noninvasive procedure is useful for tracking the location and distribution of labeled neural stem cells in rats with whole-brain irradiation．

Superparamagnetic iron oxide Magnetic resonance imaging Stem cellRadiation brain lesions Rat

2014-09-17）

（本文編輯：胥昀）

浙江省自然科學基金項目（Y2110739）

317000 臺州，溫州醫科大學附屬臺州醫院消化內科（周賢斌），放療科（丁維軍、于長輝）；中國科學院波譜與原子分子物理國家重點實驗室（雷皓）；復旦大學上海醫學院解剖組織胚胎系（汪洋）

丁維軍，E-mail：dwj1506@hotmail.com