CD97-CD55蛋白復合體在乳腺惡性腫瘤組織中的表達及臨床意義

袁曉雷 田華 朱旭明 黃斌 孫麗君 張偉軍 王震宇 李鋒 陳力

CD97-CD55蛋白復合體在乳腺惡性腫瘤組織中的表達及臨床意義

袁曉雷 田華 朱旭明 黃斌 孫麗君 張偉軍 王震宇 李鋒 陳力

目的 探討CD97-CD55蛋白復合體在乳腺惡性腫瘤組織中的表達與臨床病理因素的關系和評判預后的價值。 方法 收集212例乳腺惡性腫瘤及358例乳腺良性腫瘤組織石蠟標本制備組織芯片，采用免疫組化SP法檢測CD97抗原表位CD97EGF、CD97Stalk和CD55的表達，結合臨床資料分析其與臨床病理因素聯系。設計CD97和CD55寡核苷酸探針，應用顯色原位雜交技術檢測CD97mRNA和CD55mRNA在乳腺良、惡性腫瘤組織中的表達。采用Cox比例風險模型分析影響乳腺惡性腫瘤預后風險因素，Kaplan-Meier曲線法進行生存分析。 結果 CD97EGF和CD97Stalk在乳腺惡性腫瘤組織中表達率分別為53．3%（113/212）和65．1%（138/212）。CD55在乳腺良、惡性腫瘤組織中均有表達。顯色原位雜交顯示CD97mRNA和CD55mRNA在乳腺良、惡性腫瘤組織中染色強度差異均有統計學意義（均P＜0．01）。Cox比例風險模型分析顯示腫瘤大小、陽性淋巴結轉移數目、TNM分期、CD97EGF陽性表達是影響乳腺惡性腫瘤預后的獨立危險因子。 結論 乳腺惡性腫瘤組織可檢測到CD97-CD55蛋白復合體表達，CD97Stalk和CD97EGF兩個不同抗原表位可能在CD97參與腫瘤發生、發展機制中存在著一定的差異。乳腺惡性腫瘤組織CD97EGF陽性表達可作為預后判斷指標之一。

腫瘤 乳腺 CD97 CD55 蛋白復合體 組織芯片 免疫組織化學 顯色原位雜交

CD97是血管內皮生長因子7次跨膜蛋白（epidermal growth factor-seven-span-transmembrane，EGF-TM7）家族Ⅱ類受體成員之一，分子量約75～90kDa。EGFTM7受體包括一個信號肽，N-末端不同數目的EGF作用功能域，一段具有保守切割位點的莖桿樣結構，7次跨膜形成黏液素樣莖環結構和C端一個短小的胞內段，目前已證實在胃腸道及甲狀腺等多種上皮性腫瘤中有所表達[1]。CD55屬于膜結合型補體調節蛋白（membrane-bound complement regulatory proteins，mCRPs），CD97可與細胞間分布較為廣泛的CD55相互作用形成蛋白復合體發揮作用[2]。由于N-末端糖基化作用，CD97可形成CD97EGF和CD97Stalk等不同抗原表位，兩者的表達特點和分布范圍在腫瘤組織和細胞中具有一定的差異性[3]。本研究應用組織芯片技術對CD97EGF、CD97Stalk和CD55在乳腺惡性腫瘤組織中的表達進行檢測，結合臨床病理資料，探討其在乳腺惡性腫瘤患者預后判斷中的價值，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2007-08—2010-08杭州市蕭山區第一人民醫院收治的乳腺惡性腫瘤患者212例，其中男1例，女211例，年齡31～81（50.3±4.2）歲。術前患者均未行新輔助化療及局部放射治療。絕經前151例，絕經后60例，其中單側單發207例，單側多發2例，雙側3例；腫瘤位于右側102例，左側107例，雙側3例；腫瘤直徑＜1.0cm 15例，1.0～2.0cm 74例，2.0～5.0cm 111例，＞5.0cm 12例。根據2001年中國乳腺腫瘤病理分類[4]，非浸潤性癌16例，包括小葉原位癌2例，導管內癌11例，派杰病1例，導管內乳頭狀瘤局部癌變2例；浸潤性非特殊癌180例，包括浸潤性癌23例，浸潤性導管癌152例，浸潤性小葉癌5例；浸潤性特殊癌13例，包括黏液腺癌8例，髓樣癌3例，鱗癌2例。乳腺間葉組織來源惡性腫瘤3例，包括葉狀肉瘤1例，低度纖維母細胞肉瘤2例。TNM分期0期16例，Ⅰ期15例，Ⅱ期106例，Ⅲ期59例，Ⅳ期16例。淋巴結轉移182例，共398枚，平均淋巴結轉移數目1.87枚/例。收集同期乳腺良性腫瘤358例，均為乳腺單發病灶，其中男3例，女355例，年齡17～75（38.5±2.7）歲。病灶直徑＜1.0cm 72例，1.0～2.0cm 177例，2.0～5.0cm 99例，＞5.0cm 10例。病理類型包括乳腺纖維瘤206例，導管內乳頭狀瘤12例，單發乳腺囊性增生癥41例，乳腺增生癥伴瘤樣增生65例，乳腺積乳囊腫10例，乳腺導管擴張癥伴囊腫形成15例，乳腺脂肪瘤7例（其中男性3例），乳腺良性分葉狀腫瘤2例。

1.2 主要試劑和儀器 Anti-CD97EGF單克隆抗體（VIM-3b）及Anti-CD97Stalk單克隆抗體（MEM-180）均購自美國BD PharMingen公司，Anti-CD55鼠單克隆抗體（BRIC 216）購自美國Abcam生物公司，顯色原位雜交試劑盒購自德國Zytovision公司，組織芯片制備儀購自北京博醫康實驗儀器有限公司，CD97、CD55探針由武漢Stargene公司依據CD97蛋白基因序列（Gene Bank NM_001025160）及CD55蛋白基因序列（Gene Bank NM_001114752）應用TaqMan技術進行設計合成制備。

1.3 乳腺良、惡性腫瘤組織石蠟標本組織芯片制備采用低密度組織芯片共上樣45個點（橫軸9個點×縱軸5個點），分別制作乳腺良、惡性腫瘤組織芯片進行實驗。制備石蠟標本固定保存，編號備案。組織芯片儀進行打孔，柱狀石蠟組織條取樣置入受體蠟塊孔。制作完成的組織芯片蠟塊置于37℃烤箱中15min，-20℃冰箱低溫保存2h，修塊、切片，撈片后65℃烘烤10min，與載玻片緊密粘連后進行HE、免疫組織化學染色及顯色原位雜交實驗。

1.4 CD97EGF、CD97Stalk及CD55在乳腺良、惡性腫瘤組織中的表達 采用SP法進行組織芯片免疫組織化學染色，乳腺良、惡性腫瘤組織芯片實驗應用抗體滴度分別為：anti-CD97Stalk1∶400、anti-CD97EGF1∶400、anti-CD55 1∶200。主要實驗步驟：組織芯片切片，常規脫蠟水化，微波修復抗原15min，3%雙氧水滅活內源性過氧化物酶活性30min，滴加正常血清孵育，依次加入上述目標抗體4℃過夜，生物素標記37℃30min，辣根酶標記鏈霉卵白素30min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水封片。染色結果采用半定量計數方法[5]，由2位高級職稱病理醫師在光鏡下進行結果判定，計數方法：IRS=SI×PP（SI為陽性細胞染色強度，PP為陽性細胞百分率），SI分為4個等級：0為陰性，1為弱陽性，2為中度陽性，3為強陽性；PP＜10%為1,10%～50%為2,51%～80%為3，＞80%為4。IRS乘積最高值為12，≤3分為陰性，＞3分即為陽性，4～8分為中度陽性，＞8分為強陽性；以中度陽性和強度陽性計算陽性率。

1.5 CD97mRNA和CD55mRNA在乳腺良、惡性腫瘤組織中的表達 采用顯色原位雜交檢測。依據Gene BankCD97及CD55基因序列信息選擇目標序列應用Taqman技術合成CD97及CD55的寡核苷酸探針引物。CD97引物探針序列：GTCTGGCTGA/421/CTCTGCCGGGAGCTGAAACCAGGACTCCAGGGGCTGTGCCCGGTGGTGCCCTCAGAACT/482/CCTCGTGTGTGTCAATGCCA-CCGCCTGTCGCT GCAATCCAGG GTTCAGCTCT TTTTCTGAGA；CD55引物探針序列：CD55上游引物：GTGCCGTCCAGGTTACAGAA；CD55下游引物：TCTCCCGGATTAGGGCATGA。引物合成后經檢測合格后予以應用。CISH法檢測CD97及CD55基因擴增參照顯色原位雜交試劑盒說明書略加改進后進行。主要實驗步驟：脫蠟，蛋白酶37℃孵育消化10min，乙醇逐級脫水，適量體積的雜交緩沖液42℃預熱雜交30min，68℃新鮮變性10min，含有地高辛標記探針雜交液42℃濕盒過夜，洗滌65℃預熱10min，加地高辛抗體雜交后洗滌3min，100μl封阻液孵育30min，檢測緩沖液平衡5min，加入底物顯色液15～30min（100μl/張切片），顯微鏡下掌握染色程度用無菌雙蒸水終止染色。染色強度（顆粒數）檢測結果參照乳腺癌HER2基因檢測指南進行染色結果判斷[6]。

1.6 惡性腫瘤的隨訪 采用電話及門診復查方式進行隨訪，隨訪時間24～60個月，平均38.3個月；212例患者中失訪9例，隨訪率為95.75%。術后2年內每3個月檢查1次，以后每半年檢查1次，檢查內容包括健側乳房、胸部CT、肝臟B超及頭顱CT等，自手術始至首次復發間隔為無病生存時間（disease-free survival，DFS），隨訪DFS并作為預后判斷指標。

1.7 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件。計數資料的比較及分析采用χ2檢驗；乳腺惡性腫瘤中CD97和CD55陽性表達的關系采用Spearman相關性分析；乳腺良、惡性腫瘤組織中CD97和CD55表達強度的比較采用t檢驗。采用Cox比例風險模型分析影響預后的風險因素，Kaplan-Meier曲線法進行無病復發生存分析，log-rank檢驗比較CD97Stalk、CD97EGF兩組累積生存率。

2 結果

2.1 CD97和CD55在乳腺良、惡性腫瘤組織中的表達CD97Stalk陽性染色呈棕黃色染色顆粒表達于乳腺惡性腫瘤細胞質及細胞膜，且分布呈一定的極性改變，多位于靠近腫瘤纖維基質（圖1，見插頁），在乳腺惡性腫瘤組織中的陽性率為65.1%（138/212），在乳腺良性腫瘤組織中陽性率為25.9%(93/358)，兩者差異有統計學意義（P＜0.01）。CD97EGF陽性染色呈棕黃色染色顆粒表達于乳腺惡性腫瘤細胞質和細胞膜（圖2，見插頁），在乳腺惡性腫瘤組織中陽性率為53.3%（113/212），在乳腺良性腫瘤組織中陽性率為12.0%（43/358），兩者差異有統計學意義（P＜0.01）。CD55在良、惡性腫瘤組織中均有表達，呈棕黃色染色于癌細胞質，圍繞腺管上皮細胞周圍，部分腺管管腔內著色（圖3，見插頁），在乳腺惡性腫瘤組織組中陽性率為65.1%（138/212），在乳腺良性腫瘤組織中陽性率為87.9%（315/358），兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 CD97mRNA和CD55mRNA在乳腺良、惡性腫瘤組織中的表達 CD55mRNA原位雜交顯色多分布于腫瘤細胞質和基質中，在乳腺惡性腫瘤組織細胞中可見較多擴增表達，蘇木精染色胞核呈深紫染色（圖4，見插頁）。乳腺良、惡性腫瘤組織均有不同程度的CD97mRNA原位雜交顯色信號，良性組織中分布于細胞質，蘇木精染色胞核呈淡紫染色（圖5，見插頁），惡性組織中分布于腫瘤細胞質，蘇木精染色胞核呈深紫染色，多發生在成簇腫瘤細胞，可見較多擴增表達（圖6，見插頁）。顯色原位雜交信號強度（顆粒數）比較結果顯示，CD97mRNA在乳腺良性腫瘤組織中為2.45±0.30，惡性腫瘤組織中為3.75±0.15，差異有統計學意義（t=2.476，P＜0.01）；CD55mRNA在乳腺良性腫瘤組織中為2.60±0.75，惡性腫瘤組織中為3.10±0.80，差異無統計學意義（t=0.973，P＞0.05）。

2.3 乳腺惡性腫瘤組織CD97和CD55陽性表達的相關性分析 CD97EGF和CD55兩者在乳腺惡性腫瘤組織表達呈正相關（r=0.318，P＜0.05），CD97Stalk和CD55兩者在乳腺惡性腫瘤組織中表達呈正相關（r=0.305，P＜0.05）。

2.4 CD97、CD55表達與乳腺惡性腫瘤臨床病理特征比較 乳腺惡性腫瘤組織中CD97EGF、CD97Stalk以及CD55的表達和臨床病理特征單因素分析結果詳見表1。結果顯示：（1）CD97EGF在乳腺惡性腫瘤組織中的表達與腫瘤大小、病理類型、病理分期、組織學分級等各因素的差異有統計學意義（P＜0.05）；（2）CD97Stalk在乳腺惡性腫瘤組織中的表達與病理類型、病理分期以及淋巴結轉移狀態等各因素的差異有統計學意義（P＜0.05或0.01）；（3）CD55在乳腺惡性腫瘤組織中的表達與病理類型、組織學分級及淋巴結轉移狀態的差異有統計學意義（P＜0.05）。根據結合乳腺惡性腫瘤改良根治術后隨訪患者生存資料進行的Cox比例風險模型分析結果，進一步提示腫瘤大?。℉R=1.206，P＜0.05）、陽性淋巴結轉移數目（HR=1.332，P＜0.05）、TNM分期（HR=2.015，P＜0.05）、CD97EGF陽性表達（HR=10.481，P＜0.05）是影響乳腺癌預后的獨立危險因子，詳見表2。

2.5 CD97EGF陽性表達與乳腺惡性腫瘤患者預后關系CD97EGF陰性組60個月隨訪時間段內的總體無病生存率為86.86%（86/99），CD97EGF陽性組為62.8%（71/113），結合隨訪無病生存資料應用Kaplan-Meier法進行分析比較顯示，CD97EGF陰性組無病生存率優于陽性組，log-rank檢驗結果顯示有明顯差異（P＜0.05），隨著CD97EGF表達的增強，總體生存曲線有下降的趨勢（圖7），CD97Stalk表達組間無病生存率比較差異性不明顯。

表1 乳腺惡性腫瘤組織CD97Stalk、CD97EGF表達和臨床病理特征比較（例）

表2 乳腺惡性腫瘤患者多元回歸Cox比例風險模型預后分析

圖7 乳腺惡性腫瘤組織CD97EGF表達生存分析曲線

3 討論

1997年德國哈勒大學Hoang-Vu等[7-8]研究證實甲狀腺惡性腫瘤組織中CD97的表達強弱與腫瘤細胞的侵襲性和淋巴細胞的轉移程度有關，是甲狀腺癌去分化程度的腫瘤標記物，從此開啟了CD97在上皮性惡性腫瘤中研究。在大腸癌研究中發現，大腸惡性腫瘤邊緣組織癌細胞CD97陽性表達水平強弱與腫瘤細胞淋巴管浸潤和臨床腫瘤分期呈顯著正相關[9]；在食管癌、胰腺癌、口腔黏膜鱗狀上皮癌等上皮組織來源的惡性腫瘤中如CD97表達水平與腫瘤患者的臨床病理學特征之間存在相關性[10-11]，證實CD97陽性表達與惡性腫瘤的分化、浸潤、轉移和臨床分期有關，是腫瘤治療和預后的重要靶分子。在腫瘤細胞中的表達研究結果顯示，CD55廣泛分布于胃腸道上皮來源惡性腫瘤，在腺管管腔上皮細胞中呈極性化分布，在腫瘤基質和周圍正常結締組織中過表達，提示CD55在腫瘤發生、發展過程中具有細胞信號傳導作用，并參與腫瘤微環境的形成。CD55通過影響C3/C5轉換酶的形成，抑制同源補體級聯反應和下游效應子的激活，可非特異性抑制自然殺傷細胞的作用使腫瘤細胞逃避人體自身免疫系統的免疫攻擊[12]。CD97和CD55以受體-配體的形式相互作用參與甲狀腺、胃腸道、前列腺等多種上皮性來源惡性腫瘤細胞在腫瘤的分化、遷移、浸潤以及轉移機制中扮演了重要角色[3，10]。由于N-末端糖基化作用等因素影響，CD97形成CD97EGF和CD97Stalk等兩類不同免疫表位，對首個EGF區域結合的CD97EGF單克隆抗體染色比莖環區域結合的CD97Stalk單克隆抗體具有更嚴格的限制性，兩者的表達特點和分布范圍具有差異性。

上皮生長因子EGF受體在多種實體腫瘤細胞中表達異常或呈高表達，與腫瘤血管生成、腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移及抑制凋亡等機制相關，EGF受體與配體相互作用促進腫瘤細胞的異常增殖，提示預后不良[13]。本研究結果顯示，CD97EGF和CD97Stalk均呈棕黃色染色陽性表達于乳腺惡性腫瘤細胞質和細胞膜，CD97Stalk染色陽性細胞分布呈一定的極性改變，多分布于靠近腫瘤纖維基質；CD55陽性表達于癌細胞質，呈棕黃色染色，圍繞腺管上皮細胞周圍分布。原位雜交顯色實驗結果顯示，CD97mRNA分布于腫瘤細胞質，多發生在成簇腫瘤細胞，在乳腺惡性腫瘤組織細胞中可見較多擴增表達，HE染色胞核呈深紫染色，顯色原位雜交信號強度（顆粒數）比較結果顯示在乳腺良、惡性腫瘤組織存在擴增表達，與乳腺良性腫瘤組織中的差異均有統計學意義（均P＜0.01）。結合乳腺惡性腫瘤改良根治術后患者隨訪無病生存時間資料進行的Cox比例風險模型分析，結果表明腫瘤大小、陽性淋巴結轉移數目、TNM分期、CD97EGF陽性表達是影響乳腺癌預后的獨立危險因子。Kaplan-Meier曲線法生存分析顯示CD97EGF表達陽性在乳腺癌患者中無病生存預后相對較差。

研究顯示，CD97EGF在胃癌腫瘤組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達特點和文獻報道的CD97Stalk在大腸腫瘤中表達特點有顯著不同，CD97EGF在癌旁組織和正常組織的表達水平可作為判定胃癌組織潛在分子切緣，而CD97Stalk強陽性染色于腫瘤浸潤前沿散在分布的單個瘤細胞和小的腫瘤細胞群[11，14]。本研究采用制備乳腺良、惡性腫瘤組織芯片作為實驗平臺對CD97-CD55蛋白復合體在乳腺惡性腫瘤組織中的表達進行測定，選擇CD97EGF和CD97Stalk兩類不同免疫表位單克隆抗體進行相關實驗，在乳腺惡性腫瘤組織中均可檢測到CD97EGF、CD97Stalk和CD55的表達，CD97和CD55在乳腺惡性腫瘤組織中的表達存在明顯的相關性，研究結果進一步擴充了CD97在上皮來源惡性腫瘤中的表達譜，提示以配體和受體相互作用形式存在的CD97-CD55蛋白復合體在惡性腫瘤組織中的表達具有一定的普遍性。CD97Stalk和CD97EGF免疫組織化學染色分布特點提示兩個CD97不同免疫表位參與乳腺惡性腫瘤發生、發展機制中可能存在差異。CD55屬于膜結合型補體調節蛋白，可保護宿主細胞免遭補體的攻擊，CD55通過影響C3/C5轉換酶的形成，加速C3/ C5轉換酶的消亡，可非特異性抑制自然殺傷細胞的作用而腫瘤細胞逃避人體的自身免疫系統的免疫攻擊[15]。CD97和CD55相互作用可進一步避免惡性腫瘤細胞被自然殺傷細胞的攻擊，在惡性腫瘤的微環境條件下為逃避補體對乳腺惡性腫瘤免疫摧毀和為潛在轉移擴散創造一定的條件[2，16-17]，進一步的潛在機制有待進一步深入研究。

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（本文編輯：嚴瑋雯）

《浙江醫學》對計量單位的要求

本刊執行GB 3100～3102-1993《量和單位》中有關量、單位和符號的規定及其書寫規則，具體執行可參照中華醫學會雜志社編寫的《法定計量單位在醫學上的應用》。注意單位名稱與單位符號不可混用。組合單位符號中表示相除的斜線多于1條時應采用負數冪的形式表示，組合單位中斜線和負數冪亦不可混用，如ng/kg/min應采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。在敘述中應先列出法定計量單位數值，括號內寫舊制單位數值；如果同一計量單位反復出現，可在首次出現時注出法定與舊制單位換算系數，然后只列法定計量單位數值。量的符號一律用斜體字，如吸光度（舊稱光密度）的符號“”。血壓仍以mmHg表示。

本刊編輯部

Expression of CD97-CD55 protein complex in patients with breast malignant tumors and its clinicopathological significance

ObjectiveTo detect the expression of CD97-CD55 protein complex in breast malignant tumors and to assess its clinicopathological significance．Methods CD97-CD55 protein complex was detected in 212 paraffin specimens of breast malignant tumor tissue and 358 specimens of breast benign tumor tissue immunohistochemially by tissue micro-array chip method．The diversity of CD97 and CD55mRNA expression in benign and malignant breast tumor tissues was also detected by CD97 and CD55 oligonucleotide probe with chromogenic in situ hybridization method．The risk factors were analyzed by Cox proportional risk model and multiple regression analysis method,and Kaplan-Meier curve was adopted for survival analysis．Results CD97EGFand CD97Stalkexpressions were detected in 53．3%（113/212）and 65．1%（138/212）of breast malignant tissue,respectively．CD55 expression was detected both in benign and malignant tumor tissue．CD97 and CD55mRNA in breast malignant tumor tissue shown a visual amplification by chromogenic in situ hybridization method,and there was a significant difference compared to that in benign breast tumor tissue(P＜0．01)．Cox proportional risk model and multiple regression analysis showed that tumor size,positive axillary lymph node numbers,TNM classification and positive-CD97EGFexpression were independent risk factors for prognosis of patients with breast malignant tumor．Conclusion CD97-CD55 protein complex are expressed in breast malignant tumor tissue．CD97Stalkand CD97EGFmay play a different role in tumorogenesis and progression of breast malignant tumor．CD97EGFpositive expression in breast malignant tumor tissue can be used as an indicator for prognosis estimation．

Neoplasma Mammary gland CD97 CD55 Protein complex Tissue micro-arrary Immunochemistry Chromogenic in situ hybridation

2013-11-18）

杭州市醫藥衛生科技計劃項目（2008102147）

311200 杭州市蕭山區第一人民醫院普外科（袁曉雷、田華、朱旭明、黃斌、孫麗君、張偉軍、王震宇、李鋒）；浙江大學醫學院附屬第二醫院外科（陳力）

陳力，E-mail：chenli@mail.hz.zj.cn