靶向干擾CDK2AP1對乳腺癌MCF-7細胞體外遷移和侵襲的影響

魏任雄 李克強 毛聯鋼 李旭軍 馮偉云

●論 著

靶向干擾CDK2AP1對乳腺癌MCF-7細胞體外遷移和侵襲的影響

魏任雄 李克強 毛聯鋼 李旭軍 馮偉云

目的 探討靶向干擾細胞周期調節蛋白依賴性激酶2-關聯蛋白-1（CDK2AP1）對乳腺癌MCF-7細胞體外遷移和侵襲的影響。 方法 構建重組慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA及重組空病毒pGCLV-GFP，分別穩定轉染乳腺癌細胞系MCF-7，獲得乳腺癌細胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1。采用定量PCR法檢測兩組MCF-7細胞株的CDK2AP1mRNA表達，xCELLigence/RT-CIM實時細胞電子分析系統檢測細胞遷移能力，Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力。 結果 成功構建乳腺癌細胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1，相比MCF-7/RNAi-NC細胞組，MCF-7/RNAi-CDK2AP1細胞組的CDK2AP1mRNA表達受到明顯抑制，其細胞遷移和侵襲能力均顯著下降（P＜0.05）。 結論 乳腺癌細胞MCF-7中CDK2AP1低表達能有效抑制細胞的體外遷移和侵襲能力。

乳腺癌 CDK2AP1 shRNA 細胞遷移 細胞侵襲

乳腺癌是我國女性常見的惡性腫瘤之一，侵襲和轉移是導致乳腺癌患者死亡的最主要原因[1-2]。手術、化療和放療可以控制許多局部腫瘤，但仍無法完全根治腫瘤的轉移[3]。因此，進一步探索乳腺癌發生侵襲、轉移的相關機制，對于乳腺癌的臨床治療具有重要意義。細胞周期調節蛋白依賴性激酶2-關聯蛋白-1（CDK2-associated protein 1，CDK2AP1）定位于染色體12q24.31，由115個氨基酸組成，基因全長1 627bp，主要分布于腦、肺、乳腺、肝臟、胰腺、脾臟、腎臟、脊髓、前列腺、卵巢等部位[4]。CDK2AP1是CDK2基因的一個特異性負向調節蛋白，負責分解CDK2，同時能夠直接與DNA聚合酶α反應，影響細胞S期DNA復制調節，從而抑制腫瘤細胞的生長[5-7]。近年有學者報道，在CDK2AP1低表達的食管癌、胃癌的患者預后較差，易發生轉移[8-9]。本研究通過shRNA靶向干擾CDK2AP1，觀察其對乳腺癌MCF-7細胞遷移和侵襲能力的影響，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和SUM-159購自中科院細胞所；Gibco分裝RPMI 1640細胞培養液、胎牛血清（FBS）購自美國Invitrogen公司；重組空病毒pGCLV-GFP和重組慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA病毒液購自吉凱公司；polybrene購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；細胞總RNA抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司，cDNA逆轉錄試劑盒、SYBGreen實時熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司；CDK2AP1及β-actin基因引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；Transwell小室購自美國Promega公司；鼠抗人CDK2AP1單克隆抗體及ElivisionTM試劑盒均購于基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 MDA-MB-231、MCF-7和SUM-159乳腺癌細胞系常規復蘇，培養于含10%FBS的PRMI1640培養基中（加入1×105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素），置于含5%CO2的37℃恒溫培養箱內。

1.2.2 3種乳腺癌細胞株中CDK2AP1 mRNA的表達采用定量PCR檢測。3種乳腺癌細胞系用Trizol抽提細胞總RNA，用DU800型紫外分光光度計檢測其濃度和純度，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit將RNA逆轉錄成cDNA，然后將所得的cDNA進行定量PCR檢測。根據Genebank上CDK2AP1序列設計了擴增引物，CDK2AP1-F：AAGGAGCAACCCACCAAACC；CDK2AP1-R：ATCAACTTACAATAAACGCAGAAC。看家基因β-actinDNA擴增引物，Actin-F：GGCGGCACCACCATGTACCCT；Actin-R：AGGGGCCGGACTCGTCATACT。PCR反應體系中含有SYBR Premix Ex TaqTM 5μl，上下游引物各0.4μl，模板 cDNA 1μl，ROX Reference DyeⅡ 0.2μl，ddH2O 3.0μl，共10μl。PCR反應條件：95℃45s，95℃5s，60℃35s，共38個循環。建立標準曲線，讀取Ct值，△Ct=樣本Ct均值-內參照Ct均值，△△Ct=△Ct-（隨機陰性對照樣品Ct均值-該樣品內參照Ct均值），目的基因mRNA的相對表達量以2-△△Ct表示。

1.2.3 重組慢病毒感染 取對數生長期的MCF-7細胞，以5×104個/孔接種到6孔板，在37℃、5%CO2培養。待細胞融合度達到30%，用polybrene（8μg/ml）預處理30min，重組慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA和pGCLV-GFP的病毒感染滴度均為3E+6（TU/ml），12h后更換新鮮PRMI 1640培養基繼續培養，48h后用熒光顯微鏡觀察感染后的兩組乳腺癌細胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1的綠色熒光蛋白GFP表達情況，計算重組慢病毒轉導效率。

1.2.4 重組慢病毒感染的MCF-7細胞株CDK2AP1 mRNA表達 采用定量PCR檢測。按1.2.2所表述的相同方法步驟、PCR反應參數及結果分析，分別檢測乳腺癌細胞MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1的CDK2AP1表達情況。

1.2.5 細胞遷移能力 采用xCELLIigence/RT-CIM實時細胞電子分析系統分別檢測乳腺癌細胞MCF-7/ RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1體外遷移情況。將MCF-7/pGCLV和MCF-7/RNAi-CDK2AP1細胞分別放于不含血清培養基中生長4～24h。將培養基加入至底層小室，將頂層小室置于底層小室上面，并將兩者扣合在一起，以進行CIM-Plate 16的裝配。在獲得背景測定前，將不含血清培養基放置于頂層小室中進行水合處理，并將過濾膜放置于37℃的CO2孵育箱中1h，進行預孵育處理。于不含血清培養基中對細胞進行輕柔的胰酶消化處理，使細胞成團狀，再重新懸浮細胞。對CIMPlate 16進行平衡處理后，將CIM-Plate 16放置于RTCA DP儀器工作站中，并進行背景細胞指數的測定。然后從RTCA DP儀器站中移除CIM-Plate 16，并將細胞加入至頂層中，細胞密度為理想密度。將CIM-Plate 16放置于RTCA DP儀器站中，每隔1h對細胞遷移情況進行監測，共持續65h，通過系統測量的阻抗得到細胞指數，反映遷移細胞的數量。

1.2.6 細胞侵襲能力 采用Transwell實驗檢測。Transwell Chamber預鋪50μg/室Matrigel膠。乳腺癌細胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1分別消化離心，重懸計數活細胞數。用無血清培養液調整細胞濃度為1×105/ml，分別取0.2ml接種于Transwell Chamber的上室，同時在Transwell Chamber下室加入含10%FBS的培養液，培養24～48h后取出，用棉簽頭擦去Matrigel，用PBS洗2～3次，甲醇固定后蘇木精染色，在200倍光學顯微鏡下觀察，用10%醋酸脫色，測量洗脫液OD570值。OD值與穿膜的細胞數量成正比，從而間接反映細胞的侵襲能力，實驗重復3次。

2 結果

2.1 CDK2AP1在乳腺癌細胞系中的表達情況 熒光定量PCR檢測結果顯示，CDK2AP1 mRNA表達量由高到低依次為MCF-7＞MDA-MB-231＞SUM-159，見圖1。

2.2CDK2AP1穩定干擾細胞系的建立 選取CDK2AP1高表達乳腺癌細胞系MCF-7進行重組空病毒pGCLVGFP和重組慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA感染，同一視野白光和熒光下觀測MCF-7細胞，轉染48h后，MCF-7細胞株空病毒pGCLV-GFP（見圖2A、B）和重組慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA（見圖2C、D）轉導率均高于80%，綠色熒光蛋白GFP表達良好，成功構建乳腺癌細胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1。

圖1 3種乳腺癌細胞系中CDK2AP1 mRNA表達量

圖2 MCF-7轉染48h后綠色熒光蛋白GFP的表達（A：MCF-7/ RNAi-NC細胞明場下細胞形態；B：MCF-7/RNAi-NC細胞暗場下熒光激發GFP發光情況；C：MCF-7/RNAi-CDK2AP1細胞明場下細胞形態；D：MCF-7/RNAi-CDK2AP1 GFP細胞暗場下熒光激發GFP發光情況；×100）

2.3 重組慢病毒感染的MCF-7細胞株CDK2AP1表達 通過熒光定量PCR技術檢測發現，重組慢病毒對MCF-7的表達有較好的干擾抑制作用，相比MCF-7/ RNAi-NC細胞組，MCF-7/RNAi-CDK2AP1細胞組的CDK2AP1mRNA表達受到明顯的抑制，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 重組慢病毒感染的MCF-7細胞株CDK2AP1表達情況

2.4 抑制CDK2AP1的表達對MCF-7遷移能力的影響 檢測發現，30～60h MCF-7/RNAi-NC細胞信號明顯高于MCF-7/RNAi-CDK2AP1，表明MCF-7/RNAi-CDK2AP1較MCF-7/RNAi-NC細胞遷移能力明顯降低，說明下調乳腺癌細胞系MCF-7 CDK2AP1的表達，其腫瘤細胞的體外細胞遷移能力明顯下降，見圖3。

圖3 xCELLigence（RT-CIM）對乳腺癌細胞株MCF-7/RNAi-NC與MCF-7/RNAi-CDK2AP1遷移運動的實時監測動態圖（A：MCF-7/RNAi-NC細胞遷移情況；B：MCF-7/RNAi-CDK2AP1細胞遷移情況）

2.5 抑制CDK2AP1的表達對MCF-7侵襲能力的影響 結果顯示下調乳腺癌細胞株MCF-7 CDK2AP1的表達，其腫瘤細胞的體外侵襲能力明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 MCF-7/RNAi-NC與MCF-7/RNAi-CDK2AP1乳腺癌細胞侵襲實驗（A：兩組細胞侵襲實驗染色圖，×200；B：兩組相對侵襲細胞數比較）

3 討論

乳腺癌現已成為中國女性發病率較高的惡性腫瘤之一。我國乳腺癌的發病率和病死率都呈迅猛上升態勢。侵襲性與轉移能力是癌細胞區別于正常細胞的最基本的特征，也是導致患者腫瘤復發，病情惡化而最終死亡的病理基礎。雖然乳腺癌治療方案不斷改進，而侵襲轉移仍是導致乳腺癌患者死亡的最主要原因。

CDK2AP1最早從倉鼠口腔癌模型中分離[10]。CDK2AP1先前的研究主要集中在口腔、頭頸腫瘤細胞增殖和細胞周期調控方面。CDK2AP1是CDK2基因的一個特異性負向調節蛋白，負責分解CDK2，同時能夠直接與DNA聚合酶α反應，影響細胞S期DNA復制調節，從而抑制腫瘤細胞的生長[5-7]。有研究報道，TGF-β可激發CDK2AP1誘導腫瘤細胞上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）[11]。同時當上調倉鼠頰囊癌細胞HCPC-1的CDK2AP1表達時，其誘導的EMT促進了腫瘤細胞鄰近侵襲和遷移，但抑制腫瘤的遠處轉移[11]。另有研究報道，臨床觀察發現在CDK2AP1低表達的食管癌、胃癌的患者中預后較差，發生轉移的情況較多[8-9]。在本研究中，通過慢病毒穩定干擾乳腺癌細胞CDK2AP1表達可顯著抑制細胞的體外遷移和侵襲能力。

基于本研究和相關文獻報道，本研究小組推斷CDK2AP1在乳腺癌轉移中的可能作用及其機制為：CDK2AP1上調E-cadherin的表達，促進EMT的形成，增強乳腺癌細胞鄰近侵襲和細胞遷移能力；促進CDK2的分解，降低乳腺癌在血流中的存活能力，抑制遠處轉移克隆的形成，以上推斷尚待進一步研究進行證實。

綜上所述，干擾CDK2AP1的表達可顯著抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲，預示CDK2AP1在乳腺癌的惡性進展和轉移過程中發揮重要作用。本研究將為CDK2AP1作為乳腺癌的有效治療靶點提供實驗依據。

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（本文編輯：嚴瑋雯）

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本刊編輯部

CDK2AP1 knockdown inhibits migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cell line in vitro

WEI Renxiong,LI Keqiang, MAO Lian'gang,et al.Department of Clinical Laboratory,Ningbo Second Municipal Hospital,Ningbo 315010,China

Human breast cancerCDK2AP1 shRNA Cell Migration Cell Invasion

2014-02-17）

寧波市自然科學基金資助項目（2010A610046）

315010 寧波市第二醫院檢驗科（魏任雄現在寧波市中醫院工作），臨床研究中心（李克強、毛聯鋼、馮偉云），乳腺外科（李旭軍）

李克強，E-mail:chasejxmc@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the role of cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1(CDK2AP1)in migration and invasion of human breast cancer cells. Methods Recombinant lentivirus pGCLV-CDK2AP1-shRNA and negative control pGCLV-GFP were constructed and transfected to human breast cancer MCF-7 cells.Migration and invasion ability of MCF-7 cells were determined with xCELLigence system and Transwell chamber assay,respectively. Results Recombinant lentivirus pGCLV-CDK2AP1-shRNA and negative control pGCLV-GFP were transfected into MCF-7 cells successfully.After transfection, expression levels of CDK2AP1 mRNA in MCF-7 cells were reduced significantly(P＜0.05).Compared to control MCF-7/RNAi -NC cells,MCF-7/RNAi-CDK2AP1 significantly decreased the migration and invasion ability of MCF-7 cells. Conclusion Silence of CDK2AP1 significantly inhibits migration and invasion of human breast cancer MCF-7 in vitro.