磷酸二酯酶4D基因與腦梗死患者頸動脈粥樣硬化的關系

鄭海濱　胡興越　李衛玲　周元林　朱通偉

磷酸二酯酶4D基因與腦梗死患者頸動脈粥樣硬化的關系

鄭海濱胡興越李衛玲周元林朱通偉

【摘要】目的探討腦梗死患者磷酸二酯酶4D（PDE4D）基因SNP83的單核苷酸多態性與腦梗死患者頸動脈粥樣硬化的關系。 方法采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性方法分析350例腦梗死患者PDE4D基因SNP83的單核苷酸多態性。超聲檢查評估頸動脈斑塊和頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）內中膜厚度。 結果279例患者存在頸動脈斑塊，易損斑塊組CC+CT基因型頻率為47.1%，穩定斑塊組為30.4%，兩組比較差異有統計學意義[P=0.007，OR=2.034，95%CI（1.204～3.436）]；易損斑塊組C等位基因頻率為25.3%，穩定斑塊組則為16.8%，兩者比較差異有統計學意義[P=0.019，OR=1.682，95%CI（1.087～2.603）]。TT基因型和CC+TT基因型CCA的IMT分別為（1.06±0.08）mm和（1.13±0.08）mm，兩者差異具有統計學意義（t=8.444，P＜0.05）。 結論PDE4D基因SNP83位點單核苷酸多態性可能與浙江地區漢族腦梗死患者的頸動脈粥樣硬化相關，C等位基因可能是頸動脈斑塊易損和CCA IMT增厚的遺傳易患性標志之一。

【關鍵詞】磷酸二酯酶4D腦梗死單核苷酸多態性頸動脈疾病

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the association between the single nucleotide polymorphism of SNP83 in phosphodiesterase 4D(PDE4D)gene and carotid atherosclerosis in patients with cerebral infarction.MethodsThree hundred and fifty patients with cerebral infarction admitted in Department of Neurology,Taizhou Hospital were enrolled in the study.The polymorphism of SNP83 in PDE4D gene was detected with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).The carotid plaque and intima-media thickness(IMT)of common carotid artery(CCA)and internal carotid artery (ICA)were evaluated by ultrasonography.ResultsCarotid plaques were detected in 279 acute infarction patients,including 85 cases with carotid vulnerable plaques and 194 cases with carotid stable plaques.The frequency of CC+CT genotypes in vulnerable plaque group was significantly higher than that in stable plaque group（47.1%vs 30.4%,P=0.007,OR=2.034,95%CI: 1.204～3.436）,and the frequencies of C allele were 25.3%and 16.8%in the two groups,respectively（P=0.019,OR=1.682,95% CI:1.087～2.603）.The IMT of CCA in patients with TT and CC+TT genotypes was 1.06±0.08mm and 1.13±0.08mm,respectively（t=8.444,P＜0.05）.ConclusionThe single nucleotide polymorphism of SNP83 in PDE4D gene is associated with carotid atherosclerosis in patients with cerebral infarction and C allele may be a predictor for the susceptibility of carotid vulnerable plaque and the increased IMT of CCA.

【 Key words】 Phosphodiesterase 4DCerebral infarctionSingle nucleotide polymorphismCarotid artery disease

腦卒中是全球性的公共衛生問題，是世界性的致死、致殘的主要原因，也是目前人類疾病三大死亡原因之一。我國是腦卒中的高發國家，其中腦梗死約占70%，其最常見的病因是動脈粥樣硬化。冰島的de－CODE遺傳學研究組在2003年從單核苷酸多態性角度最早報道了磷酸二酯酶4D（phosphodiesterase，PDE4D）基因與腦卒中的相關性，發現PDE4D基因多個位點與頸動脈源性腦梗死有關[1]。后續針對PDE4D基因與腦梗死的相關性研究較多，但少見涉及發病機制的相關報道。本研究擬探討PDE4D基因的SNP83單核苷酸多態性與浙江省漢族人群腦梗死患者頸動脈粥樣硬化的關系，以闡明其與腦梗死相關聯的可能機制。

1　對象和方法

1.1對象選擇2010-02—10在浙江省臺州醫院神經內科首次因腦梗死住院的患者350例，經頸動脈超聲檢查證實存在頸動脈粥樣硬化斑塊279例。根據Mathiedsen等[4]制定的標準，將頸動脈斑塊呈高回聲的患者納入穩定斑塊組，呈混合回聲、低回聲的患者納入易損斑塊組。穩定斑塊組共194例，其中男106例，女88例，年齡38～86（65.66±9.57）歲；易損斑塊組85例，男45例，女40例，年齡36～87（65.12±10.91）歲。入院時發病時間均≤72h，診斷均符合1995年全國第四屆腦血管病學術會議制定的標準[2]，排除無癥狀性腦梗死、梗死后出血和腦出血。所有研究對象均為浙江地區無血緣關系的漢族人。既往均無腦卒中史，排除感染性疾病、甲狀腺疾病、風濕性疾病、血液系統疾病、急性心肌梗死、心房顫動、嚴重冠狀動脈狹窄、腹主動脈瘤、嚴重肝腎功能不全、結核、妊娠、哺乳期婦女及1個月內有手術、外傷史的患者。

1.2主要試劑飽和酚為AMRESCO產品，2×Master－Mix購自北京天根生化科技有限公司，限制性內切酶Tai I及其緩沖液為New England Biolabs公司產品，PCR產物純化試劑盒購自上海捷瑞公司，引物由上?；倒竞铣?。

1.3方法

1.3.1吸煙史及飲酒史的判定≥10支/d且煙齡≥1年者判定為有吸煙史，戒煙10年以上判為無吸煙史；飲酒≥1年且男性酒精攝入量＞40g/d或女性酒精攝入量＞20g/d判定為有飲酒史。

1.3.2頸動脈超聲評估由指定超聲科高年資醫師專人操作。舒張末期測量頸總動脈分叉處近端1cm、頸總動脈分叉處以及頸內動脈起始段1 cm后壁的內中膜厚度（intima-media thickness，IMT），雙側各測量3次，取其平均值，記錄頸總動脈（CCA）的IMT和頸內動脈（ICA）的IMT數值。

1.3.3標本采集抽取入組者入院第2天的清晨空腹靜脈血2ml，以EDTA-Na2抗凝，用于基因組DNA抽提，保存于-86℃冰箱中凍存備用。

1.3.4單核苷酸多態性分析采用PCR限制片段長度多態性檢測方法。（1）DNA的抽提：采用低滲溶血-酚/氯仿法從白細胞中抽提基因組DNA，適量滅菌雙蒸水溶解，核酸定量分析儀測定DNA濃度和A260/A280比值，將比值位于1.7～2.0者作為PCR擴增模板。（2）PCR擴增SNP83位點，上游引物為5′-GATTTATGTCTTA TACTTTC-3′，下游引物為5′-TGCTTTTTGAAGATGCATACTTTGT-3′。PCR反應體系為上下游引物0.5μl+ 0.5μl（各 20μmol/L），2×MasterMix12.5μl，DNA模板0.1μg，加雙蒸水至總體積25μl。PCR反應條件：預變性95℃，2min；變性94℃，45s；退火58℃，45s；延伸72℃，1min，共35個循環，吸取擴增產物6μl，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像分析PCR產物特異性。（3）酶切反應：取經純化后的PCR產物進行酶切，反應體系包括PCR產物1μg，10×緩沖液2μl，限制性內切酶Tai I 10U，加雙蒸水至總體積20μl，置37℃水浴酶切16h后，終止酶切反應，產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，凝膠成像系統判定結果。

1.4統計學處理采用PASW Statistics 18統計軟件。用基因計數法計算兩組基因型和等位基因頻率，等位基因頻率=（2×純合子數+雜合子數）（/2×受檢人群），頻率比較采用χ2檢驗，以比值比（OR）及其95%CI表示相對風險度；計量資料以表示，采用獨立樣本t檢驗。采用非條件性logistic回歸篩選危險因素。

2　結果

2.1穩定斑塊與易損斑塊組臨床資料的比較見表1。

表1　穩定斑塊與易損斑塊組臨床資料的比較

由表1可見，穩定、易損斑塊患者間的性別、年齡、高血壓病史、糖尿病史、吸煙史、飲酒史、血壓、體重指數、空腹血糖、血脂、纖維蛋白原水平等指標的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.2危險因素分析見表2。

由表2可見，最終進入模型的危險因素有甘油三酯、LDL-C、CC+CT基因型，說明PDE4D基因SNP83位點突變是腦梗死患者頸動脈斑塊易損性的危險因素之一。

2.3PDE4D基因SNP83位點PCR-RFLP檢測見圖1。穩定斑塊組和易損斑塊組的SNP83基因型分布見表3。

由圖1可見，PDE4D基因SNP83位點PCR擴增產物大小為368bp，經限制性內切酶Tai I酶切后，純合子CC基因型為152bp、216bp兩個片段，純合子TT基因型無酶切位點，為1個368bp片段，雜合子CT基因型酶切后可見152bp、216bp、368bp共3個片段。

表2　非條件Logistic回歸分析危險因素

圖1　SNP83位點PCR擴增產物經內切酶TailⅠ酶切后行2.5%瓊脂糖凝膠電泳圖[泳道1為100bp DNA marker，泳道2～3為CT基因型（152bp、216bp、368bp），泳道4～6為TT基因型（368bp），泳道7為CC基因型（152bp、216bp）]

表3　穩定斑塊與易損斑塊組間SNP83位點基因型和等位基因頻率比較[例（%）]

由表3可見，經χ2檢驗符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究對象來自同一個總體，具有群體代表性（χ2=0.112和1.849，P=0.738和0.174）。易損斑塊組CC+CT基因型頻率與穩定斑塊組比較差異有統計學意義，易損斑塊組C等位基因頻率分布與穩定斑塊組比較差異有統計學意義。

2.4PDE4D基因SNP83位點不同基因型患者之間CCA和ICA的IMT比較見表4。

表4　PDE4D基因SNP83位點不同基因型患者之間的CCA和ICA的IMT比較（mm）

由表4可見，TT基因型和CC+TT基因型CCA的IMT差異有統計學意義（t=8.444，P＜0.05），而ICA的IMT差異無統計學意義（P＞0.05）。

3　討論

PDE是一個多基因大家族，PDE4D是PDE超家族的成員之一。PDE4D基因位于5q12，其長度大約1.5Mb，至少有22個外顯子，編碼至少9個不同的異構體[3]。已有較多研究提示PDE4D基因與缺血性卒中可能存在較為密切的關聯。如Staton等[4]在對澳大利亞人群的一份病例對照研究發現，PDE4D基因與腦梗死有強相關性，其中SNP89、SNP87、SNP83均為代表性的位點。進一步研究發現，PDE4D基因不同位點基因多態性與腦梗死的關聯可能受人種、地域等相關因素影響。SNP83位點的基因多態性與亞洲人腦梗死的關系在多項研究中已得到證實，如印度的Munshi等[5]的研究就提示SNP 83基因多態性和大動脈粥樣硬化性卒中及小動脈閉塞型卒中這2個亞型相關，并和常見的危險因素如糖尿病、吸煙等相關。進一步針對中國漢族人群的相關研究也得到類似結果，Li等[6]發現SNP83基因多態（T/ C）和漢族人腦梗死有關聯，而近期王漢旻等[7]針對中國漢族人群PDE4D基因與動脈粥樣硬化血栓形成性腦卒中的相關研究也表明，PDE4D基因SNP83是動脈粥樣硬化血栓形成性腦卒中的危險基因。

動脈粥樣硬化是腦梗死和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等各種血管事件的主要危險因素，頸動脈粥樣硬化更是與腦梗死具有密切關聯[8]。易損斑塊不可預測地破裂、血小板激活和血栓形成是動脈粥樣硬化性腦梗死重要的發病機制之一[9]。Liao等[10]發現PDE4D基因的rs702553多態性與頸動脈的斑塊形成密切相關，TT等位基因型的斑塊危險性更大。本研究發現在浙江漢族人群中，易損斑塊組PDE4D基因SNP83的CC+CT基因型比例明顯高于穩定斑塊組，且C等位基因頻率也高于穩定斑塊組。一般認為，IMT增厚是頸動脈粥樣硬化的表現，Hedera等[11]研究發現腦梗死患者的IMT明顯高于健康人群。我們通過對PDE4D基因SNP83位點不同基因型間的CCA IMT和ICA IMT的比較，發現CC+CT基因型CCA的IMT顯著增高。均提示PDE4D基因SNP83位點與腦梗死患者的頸動脈粥樣硬化具有密切關聯。

在動脈粥樣硬化過程中，血管平滑肌細胞的遷移、增殖，并與炎性病變內的炎性成分形成混合物，導致動脈壁增厚，并進一步參與了覆蓋在脂質核心和壞死組織上的纖維帽的形成過程，血管平滑肌細胞還與細胞外基質的合成與分泌有關，相關異常可以造成使纖維帽強度減弱，斑塊變得易損[12]。PDE4D基因的蛋白產物PDE4D可以通過水解細胞內的第二信使（cAMP，環磷酸腺苷）來促進平滑肌細胞的增殖和遷移加速[13]，這是頸動脈粥樣硬化過程中的關鍵事件，也已被動物實驗模型所證實[14]。我們推測PDE4D基因SNP83的C等位基因可能通過調控PDE4D基因的表達而影響血管平滑肌細胞的增殖、遷移和細胞外基質的分泌等相關過程，從而使CCA的IMT增厚，影響頸動脈斑塊的穩定性。

本研究表明，PDE4D基因SNP83位點的CC+CT基因型可能與浙江漢族腦梗死患者的頸動脈粥樣硬化相關，C等位基因可能影響頸動脈斑塊的穩定性和CCA IMT的增厚，可能是兩者的遺傳易患基因。PDE4D基因SNP83的單核苷酸多態性有望于應用于腦梗死患者頸動脈粥樣硬化的早期評估和治療。

4　參考文獻

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（本文編輯：楊麗）

更正啟事

本刊2014年第7期第602頁表1“例7”下方增補一行：

例858男頸總動脈雙側右側85%左側50%腦梗死鼻咽癌6

特此更正。

本刊編輯部

收稿日期：（2013-03-25）

作者單位：317000浙江省臺州醫院神經內科（鄭海濱、李衛玲、周元林、朱通偉），浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院神經內科（胡興越）

通信作者：胡興越，E-mail：Huxingyue2003@126.com

Association between phosphodiesterase 4D gene polymorphism and carotid atherosclerosis in patients with cerebral infarction

ZHENG Haibin，HU Xingyue，LI Weiling，et al.Department of Neurology，Taizhou Hospital of Zhejiang Province,Taizhou 317000,China