長時間離心運動過程中及運動后不同來源ROS介導大鼠骨骼肌核因子Kappa B核轉入

廖鵬，何慶華，彭海燕，李飛飛，邢桂磊，張勇

長時間離心運動過程中及運動后不同來源ROS介導大鼠骨骼肌核因子Kappa B核轉入

廖鵬1，何慶華2，彭海燕2，李飛飛2，邢桂磊2，張勇3

目的：觀察長時間離心運動過程中和運動后大鼠骨骼肌不同來源ROS與核因子Kappa B（NFκB）核轉入的關系。方法：3月齡雌性SD大鼠30只隨機分為5組（n=6）。6只大鼠作為不運動對照（C），安靜狀態下處死；其余大鼠以25 m/min、-10%跑臺運動，分別于運動1 h（E1 h）、運動2 h（E2 h）、運動2 h后6 h（E2 h+6）和24 h（E2 h+24）處死動物。結果：（1）E1 h、E2 h和E2 h+24骨骼肌核蛋白p65表達量較C顯著提高，E2 h+6核p65表達量較E2 h顯著降低；（2）骨骼肌順烏頭酸酶活性在E1 h、E2 h和E2 h+6較C顯著降低，在E2 h+6和E2 h+24較E2 h顯著提高；（3）E2 h+24骨骼肌H2O2含量較C顯著升高；（4）E2 h+24骨骼肌髓過氧化物酶活性較C和E2 h顯著提高；（5）各組骨骼肌MnSOD mRNA表達量無組間差異，但E2 h、E2 h+6和E2 h+24骨骼肌TNF mRNA表達量較C顯著提高；（6）血清HMGB1含量C組顯著低于E1 h、E2 h和E2h+24；E2 h+24較E2 h顯著提高；（7）隨運動和運動后時間延長，骨骼肌形態學異常及炎細胞浸潤逐漸增多。結論：來自骨骼肌線粒體和呼吸爆發的ROS可能先后分別參與了運動過程和運動后2次NFκB核轉入的觸發。

氧化還原狀態；線粒體；延遲性肌肉損傷；呼吸爆發；p65

骨骼肌的劇烈收縮會導致細胞啟動和關閉一系列基因的表達以應答運動應激[1]。NFκB是一種具備多向調節作用的轉錄因子，其活化及失活是細胞應答運動的最重要基礎之一[2-3]。NFκB活化的關鍵步驟是由胞漿轉位入核，這一過程由細胞親氧化狀態啟動，應激刺激嚴重時一些炎癥因子（如HMGB1）也參與這一過程[3]。但是，已知多途徑參與運動骨骼肌ROS生成[5]，不同來源的ROS是否都參與運動應激中NFκB核轉入，何時參與，貢獻如何，目前并無證據給出明確解釋。

長時間離心運動會導致線粒體ROS大量生成，同時造成骨骼肌損傷又會引起延遲性呼吸爆發。本研究的目的是觀察由長時間離心運動導致的不同ROS來源對NFκB核轉入的影響，這一問題的探索無疑會對深化理解NFκB這一多種病理生理干預靶向做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡健康雌性SD大鼠30只，體重（278.7±16.3）g（250～ 300 g），購自軍事醫學科學院實驗動物中心，實驗動物質量合格證號0047959，在通風、溫度、濕度適宜的動物室內飼養。

1.2 運動模型及分組

新環境飼養1周后，所有SD大鼠每日以15 m/min、0%坡度運動15 min。1周后重新稱重，將30只大鼠隨機分為5組，每組6只，分別于跑臺以25 m/min、-10%坡度運動。以運動前安靜狀態（C）、運動1 h（E1 h）、運動2 h（E2 h）、運動2 h后6 h（E2 h+6）和運動2 h后24 h（E2 h+24）為實驗觀測記錄點。運動過程采用聲音或毛刷刺激大鼠尾部，所有運動動物均能完成設定時間的運動。

1.3 組織準備

于各實驗觀測點10%水合氯醛麻醉后活殺動物，腹主動脈穿刺取血分離血清，-20℃保存，取股外側肌肉10%甲醛鈣固定或-80℃保存。

1.4 骨骼肌核蛋白抽提

用Pierce NE-PER?Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents kit進行核蛋白抽提。

1.5 骨骼肌線粒體抽提

緩沖介質沖洗骨骼肌后勻漿，4℃600 g離心；薄紗布過濾后4℃1 7000 g離心；5 mL緩沖介質懸浮線粒體沉淀。

1.6 骨骼肌NFkB亞基p65核蛋白表達量測定

Western Blot測定骨骼肌細胞核NFkB亞基p65核蛋白表達量。核蛋白定量后，常規電泳分離、轉膜；Rabbit Anti-NFκB p65 IgG、和Mouse Anti-α-Tubulin IgG分別用PBST稀釋成1：100和1：500的工作液，Goat Anti Rb IgG-HRP和Goat Anti Mouse IgG-HRP用PBST稀釋成1：10 000和1：2 000的工作液；一抗室溫孵育2 h，二抗室溫孵育1 h；以ECL反應液做發光底物，反應后與X光膠片壓片、顯影、定影；以凝膠成像系統拍片。

1.7 骨骼肌線粒體順烏頭酸酶相對活性測定

取線粒體加入細胞裂解液提取順烏頭酸酶；加反應緩沖液測反應體系240 nm下1 min中內吸光值變化。以各實驗觀測點吸光度變化相對于安靜狀態吸光度變化的比值反映順烏頭酸酶相對活性。

1.8 骨骼肌髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）活性測定

按南京建成生物工程研究所試劑盒說明將定量骨骼肌蛋白及各種試劑按比例混合、分步驟反應。460 nm處測OD值，以每克蛋白在37℃反應體系中H2O2被分解1 mmol定義為1個MPO活性單位（U/mg pro）。

1.9 骨骼肌H2O2含量測定

按南京建成生物工程研究所試劑盒說明將骨骼肌蛋白及各種試劑按比例混合、分步驟反應后，于405 nm處測吸光度值，H2O2含量單位為nmol/mg pro。

1.10 骨骼肌MnSOD、TNFa mRNA表達量測定

實時熒光定量PCR用于檢測骨骼肌MnSOD、TNFa基因表達。取骨骼肌液氮下研磨，加1mlTrizol勻漿，抽提總RNA。瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶完整性，測OD260/280值>1.8，計算RNA含量。

取2 ug RNA進行逆轉錄。引物序列：MnSOD，上游5'-AGAGTTGCTGGAGGCTATCAAG-3'，下游50-CAGTGGGT CCTGATTAGAGCA-3'；TNFa，上游5'-TACTGAACTTCGGGG TGATTGGTCC-3'，下游5'-CTTGGCCAGCGCCTCGTGGT-3'；β-Actin，上游5'-TGGTGGGTATGG GTCAGAAGGACTC-3'，下游5'-CATGGCTGGGGT GTT GAAGGTCTCA-3'。

cDNA樣品與SYBR GREEN、上游和下游引物混合，短暫離心后進行擴增反應。以β-Actin為內參，根據公式2-□□Ct計算目的基因相對表達量。

1.11 血清HMGB1含量

血清HMGB1含量按Shino-Test公司的ELISA試劑盒說明測定。酶標儀測450 nm處吸光值，血清中HMGB1濃度與顏色的深淺、OD值大小呈正相關，根據標準品和樣品的OD值，計算樣本中HMGBl含量。

1.12 骨骼肌形態學變化

骨骼肌固定、切片后HE染色觀察形態學改變。動物麻醉后迅速取骨骼肌切塊，10%甲醛鈣固定；修整、脫水、透明、浸蠟后制成蠟塊，切片4 μm厚。切片二甲苯I、II、III脫蠟，梯度酒精脫水；蘇木素、伊紅染色；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡觀察。

1.13 統計學處理

實驗數據由均值±標準誤表示。用SPSS17.0對數據進行單因素方差分析。F值顯著性（P<0.05），用Bonferroni（方差具有齊次性）或Tamhane（方差不具齊次性）進行2組間差異的檢驗。所有檢驗的顯著性水平定為P<0.05。

2 結果

2.1 骨骼肌NFkB亞基p65核蛋白表達量

E1h（P<0.01）、E2 h（P<0.01）和E2 h+24（P<0.01）骨骼肌細胞核NFκB亞基p65表達量較C顯著提高，E2 h+6（P<0.01）核p65表達量較E2 h顯著降低（見圖1）。

圖1 長時間離心運動對骨骼肌細胞核p65表達量的影響Figure1 Western blot analysis of p65 in the nuclear extraction of rat skeletal muscle withtubulin served as control

2.2 骨骼肌線粒體順烏頭酸酶活性

E1h（P<0.05）、E2 h（P<0.05）和E2 h+6（P<0.05）骨骼肌線粒體順烏頭酸酶活性較C顯著降低；E2 h+6（P<0.05）和E2 h+24（P<0.05）順烏頭酸酶活性較E2 h顯著升高（見圖2）。

圖2 長時間離心運動對骨骼肌線粒體順烏頭酸酶活性的影響Figure2 Activities of mitochondrial aconitase in rat skeletal muscle

2.3 骨骼肌MPO活性

E2 h+24骨骼肌MPO活性較C（P<0.05）和E2 h（P<0.05）顯著升高（見圖3）。

圖3 長時間離心運動對骨骼肌MPO活性的影響Figure3 Activities of MPO in rat skeletal muscle

2.4 骨骼肌H2O2含量

E2 h+24骨骼肌H2O2含量較C（P<0.05）顯著升高（見圖4）。

圖4 長時間離心運動對骨骼肌H2O2含量的影響Figure4 Concentrations of H2O2in rat skeletal muscle

2.5 骨骼肌MnSOD及TNFa mRNA表達

骨骼肌MnSOD mRNA表達量無組間差異（見圖5）。E2 h、E2 h+6和E2 h+24骨骼肌TNFa mRNA表達量較C顯著提高（P<0.05）；E2 h+6和E2 h+24骨骼肌TNFa mRNA表達量較E2 h顯著提高（P<0.05）（見圖5）。

2.6 血清HMGB1含量

E1 h（P<0.05）、E2 h（P<0.01）和E2 h+24（P<0.01）血清HMGB1含量較C顯著提高；E2 h+6血清HMGB1含量較E2 h顯著降低（P<0.01）；E2 h+24血清HMGB1含量較E2 h顯著提高（P<0.01）（見圖6）。

圖5 長時間離心運動對骨骼肌MnSOD和TNF mRNA含量的影響Figure5 Real-time PCR analysis of MnSOD and TNF in rat skeletal muscle

圖6 長時間離心運動對血清HMGB1含量的影響Figure6 Serum HMGB1concentrations during and after downhill running

2.7 骨骼肌的形態學變化

HE染色C組表現正常骨骼肌細胞形態（見圖7A），Ex1 h組骨骼肌細胞橫紋偶見灶性模糊（見圖7B），E2 h組骨骼肌細胞見散在橫紋消失及間質充血（見圖7C），E2+6 h部分骨骼肌細胞橫紋消失（見圖7D）。間質散在血管擴張充血及炎細胞浸潤，E2 h+ 24組骨骼肌細胞橫紋大部分消失，胞漿淡染，核中移，間質炎癥細胞浸潤（見圖7E）。

圖7 長時間離心運動前后骨骼肌細胞的形態學變化Figure7 Hematoxylin and eosin stain of skeletal muscle in rats

3 討論

哺乳動物NFκB異源二聚體p50/p65只有從胞漿轉位至細胞核才能與應答元件結合啟動和/或關閉靶基因表達[2-3]。這一過程需要細胞的氧化環境觸發一系列激酶反應，最終通過胞漿p50/p65抑制因子IκB的酶解，暴露出p65的核定位信號并被轉運受體識別后才能發生，核p65蛋白表達量的顯著提高是其重要標志[3]。ROS是哺乳動物骨骼肌細胞最重要的氧化劑，也是細胞氧化還原狀態最重要的調節因子[4-5]。但是，骨骼肌細胞存在多種ROS生成途徑[5]，這些途徑生成的ROS是否都參與、何時參與NFκB核轉入、參與程度如何，目前并無研究做出滿意解釋。

線粒體呼吸鏈電子漏出和呼吸爆發是長時間離心運動骨骼肌ROS的2個主要生成途徑[4-5]。長時間的骨骼肌收縮在提高線粒體呼吸鏈能量轉換效率的同時會通過電子漏生成大量ROS，而長時間離心運動又會導致運動骨骼肌微損傷，誘發延遲性呼吸爆發及炎癥反應，積極參與對損傷骨骼肌的修復[6]。

超氧陰離子（O2—.）是線粒體電子漏生成的第一個ROS，可特異性氧化順烏頭酸酶活性基團鐵硫簇[7]。線粒體順烏頭酸活性水平與O2—.生成速率呈反比，能夠精確反映線粒體ROS的生成速率[8]。本研究觀察到，運動過程中線粒體順烏頭酸酶活性的顯著降低一直持續到2 h運動后6 h，至2 h運動后24 h其活性又恢復正常。表明，在長時間有氧運動過程中顯著提高的線粒體ROS生成速率一直持續至運動后，但隨運動結束時間的延長，伴隨骨骼肌能量需求相對降低，線粒體ROS生成速率又降低至安靜水平。

MPO是細胞呼吸爆發的標志酶[6]。長時間離心運動造成的運動骨骼肌微損傷會啟動細胞炎癥等保護機制。炎癥部位的趨化吞噬細胞釋放蛋白酶和產生大量氧代謝物易化清除、吞噬異物。其中，吞噬細胞MPO利用NADPH氧化酶催化生成的H2O2和氯離子產生次氯酸，形成更具氧化活性的自由基。因此，MPO活性提高意味著大量ROS生成，是趨化吞噬細胞的功能和激活標志。本研究觀察到，離心運動后24 h骨骼肌MPO活性較運動前和運動過程顯著升高，表明本研究離心運動模式確實誘導了延遲性呼吸爆發。的確如此，在對應時間點（運動后24 h），確實觀察到骨骼肌H2O2含量較運動前顯著升高。形態學證據也表明，隨運動和運動后時間延長，運動骨骼肌細胞損傷和炎癥細胞浸潤程度逐漸加重。

但是，本研究離心運動至結束后6 h內并未出現骨骼肌H2O2含量的顯著性改變。提示，骨骼肌氧還狀態并未隨運動過程中線粒體ROS生成速率的顯著提高而改變。事實上，細胞ROS生成速率的提高并不總意味著其細胞水平的顯著改變。運動過程中細胞的抗氧化系統總是努力將氧化還原狀態維持在穩定水平，NFκB的核轉入活化參與這一穩態平衡的維持[1，5]。

本研究的重要結果是，與長時間離心運動中和運動后24 h先后觀察到的2個不同來源的ROS生成增多峰相對應，運動骨骼肌細胞NFκB亞基p65的核蛋白表達量也在運動過程中和運動后24 h先后依次顯著提高。表明，運動過程中和運動后24 h先后依次出現了2次胞漿NFκB的核轉入，且這2次NFκB核轉入可用長時間離心運動中和運動后不同來源的ROS解釋。

NFκB是一個多效能的轉錄因子，可接受上百種細胞刺激，參與啟動上百個基因的表達[2]。如果2個不同來源的ROS先后分別參與啟動NFκB在運動過程中和運動后的2階段活化的話，必然有其特殊的生理意義。本文認為，NFκB在運動過程中的第1次活化可能與細胞對運動應激的快速應答有關[1]。這一細胞生理過程可能涉及能量轉換、氧化還原穩態以及肌肉、血管和氧張力調節等各個方面。作為NFκB靶點的一些轉錄因子、抗氧化酶、急性期蛋白、低氧誘導因子乃至一些早期炎癥因子在長時間運動中的表達無不與之有關。

為驗證上述推論，在本研究中觀察了NFκB的2個靶基因MnSOD和TNFa mRNA在運動前后骨骼肌的表達量變化。Mn-SOD在線粒體歧化超氧陰離子為過氧化氫而阻止通過Haber-Weiss反應產生更為活躍的ROS羥自由基，而運動過程中線粒體是超氧陰離子的主要來源，但是沒有觀察到MnSOD mRNA在運動前后的顯著性差異。事實上，多數研究都注意到急性運動過程中MnSOD基因表達量不會出現顯著變化。HOLLANDER等[9]觀察到，急性力竭運動活化骨骼肌NFκB，而MnSOD mRNA表達量較安靜狀態的顯著提高出現在運動后1～2 h。此外，可能有氧運動過程中機體的抗氧化系統足以對抗伴隨的氧化應激。本研究中，線粒體ROS生成速率在運動過程中升高，但H2O2水平維持不變也似乎支持這一假設。

TNFa是公認的早期促炎因子，在組織炎癥、細胞趨化、免疫介導、損傷修復等一系列非特異性應激應答中扮演重要角色。本研究觀察到，TNFa mRNA表達量隨運動和運動后時間延長逐漸增高。NFκB在運動中的活化選擇性啟動靶基因表達值得關注。

NFκB諸多抑制因子也是其自身的靶基因。NFκB活化的觸發因素一旦去除，如本研究中線粒體ROS生成速率下降時，這些前期表達的NFκB抑制因子會迅速入核將p65核轉出[10]。這可能是本研究運動后6 h骨骼肌細胞核p65蛋白表達量下降的原因。

但是TNFa mRNA表達量為什么在NFκB核轉入減弱后仍隨運動后時間延長逐漸增高？骨骼肌長時間的拉長式收縮還會導致延遲性呼吸爆發，其ROS生成速率和量顯著高于線粒體呼吸鏈，很可能是本研究運動后24 h H2O2水平顯著提高的原因。近期研究表明，呼吸爆發而非線粒體呼吸鏈來源的ROS才是損傷組織免疫、修復的重要原因[11]。在運動后24 h觀察到的NFκB第2次核轉入很可能由呼吸爆發生成的ROS參與觸發。此次，NFκB活化的生理意義可能涉及免疫與修復，主要表現為次晚期和晚期炎癥因子、抗氧化酶類等細胞因子的表達[12]，是機體對不適宜運動適應的重要細胞事件。

本研究另一重要結果是，血清HMGB1含量也出現了運動前后2次升高，且運動后24 h的增加水平顯著高于運動2 h。HMGB1是一種高度保守的核蛋白，也是公認的具有重要臨床意義的晚期促炎因子。與細胞膜RAGE結合后，HMGB1就會通過影響胞漿氧還狀態激活NFκB、MAPK、纖溶酶原激活抑制物、Cdc42與Rac等一系列調節因子，從而放大促炎效應[12]，HMGB1在運動應答中的重要意義必然會成為運動醫學的研究熱點。

4 小結

長時間離心運動中，線粒體ROS生成增多和運動結束后延遲性呼吸爆發可能分別是運動過程中和運動結束后2次NFκB核轉入的重要誘因。

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Different Sources of ROS Contribute to NFκB Nuclear Import in Rat Skeletal Muscle During and After EccentricExercise

LIAO Peng1，HE Qinghua2，PENG Haiyan2，Li Feifei2，XING Guilei2，ZHANG Yong3
（1.Dept.of Health and Sport Science，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；2.Dept.of Postgraduate，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；3.Institute of Sport Medicine，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China）

Aim：To investigate the contribution of different sources of ROS to NFκB nuclear import in rat skeletal muscle during and after eccentric exercise. Methods：Female SD rats（age 3 mo）were randomly divided into the following five groups（n=6）：ran on the treadmill at 25 m/min，-10%grade for 1（E1h）or 2 h（E2 h）and were killed immediately；ran for 2 h and killed at 6 h（E2 h+6）or 24 h（E2 h+24）after exercise；or killed at rest as controls（C）.Results：The nuclear accumulation of p65 showed progressive increases in muscles during eccentric exercise.This change was accompanied by a progressive decrease of mitochondrial aconitase activity.At 24 h，there were marked increases in H2O2concentration，myleoperoxidase activity，and inflammatory cell infiltration along with nuclear accumulation of p65 in muscle.The serum contents of HMGB1 were significantly elevated during exercise and at 24h after exercise.For muscular target genes of NFκB activation，no significant differences of MnSOD mRNA levels were shown among groups，but the mRNA levels of TNFα in E2h，E2h+6，and E2h+24 were significantly higher than C.Conclusion：Increased mitochondrial O2—.during eccentric exercise and elevated H2O2 during respiratory burst can explain the biphasic nuclear import of NFκB during and after exercise respectively.

redox state；mitochondria；delayed onset muscle damage；respiratory burst；p65

G 804.2

A

1005-0000（2014）04-286-04

2014-04-05；

2014-06-28；錄用日期：2014-06-29

天津市教委科研計劃一般項目（項目編號：20080608）；天津體育學院博士科研啟動項目

廖鵬（1969-），男，山東濟寧人，博士，副教授，研究方向為運動氧化應激研究。

1.天津體育學院健康與運動科學系，天津 300381；2.天津體育學院研究生部，天津 300381；3.天津體育學院運動醫學研究所，天津 300381。