蘆薈大黃素對(duì)非酒精性脂肪性肝炎細(xì)胞模型脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的影響

戴娜，周培，張瑩瑩，王炳芳

（1．江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇昆山215300；2．江蘇大學(xué)研究生院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

蘆薈大黃素對(duì)非酒精性脂肪性肝炎細(xì)胞模型脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的影響

戴娜1，周培2，張瑩瑩2，王炳芳1

（1．江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇昆山215300；2．江蘇大學(xué)研究生院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：探討蘆薈大黃素（aloe-elodin，AE）對(duì)非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）細(xì)胞模型脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的影響。方法：將正常人肝細(xì)胞株L-02分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組用普通培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組按培養(yǎng)基含30%脂肪乳劑終濃度不同再分為0．25，0．5，0．75，1mL／L組，培養(yǎng)72 h后予以油紅O染色，觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)脂肪滴數(shù)量，測(cè)定培養(yǎng)液谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、三酰甘油含量。選擇最合適濃度（0．5 mL／L組）建立NASH模型，再設(shè)立對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入10－4，10－5，10－6mmol／L的AE，分別于培養(yǎng)24，48，72 h監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量、三酰甘油含量和細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛、內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等指標(biāo)。結(jié)果：用含30%脂肪乳劑0．5 mL／L的培養(yǎng)液培養(yǎng)L-02細(xì)胞株72 h，成功建立NASH肝細(xì)胞模型。不同濃度AE干預(yù)NASH細(xì)胞72 h后，培養(yǎng)液中ALT、AST、丙二醛、內(nèi)毒素、TNF-α等含量均較模型組明顯下降，SOD含量較模型組明顯升高（P＜0．05）。結(jié)論：AE可改善肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度，減輕炎癥反應(yīng)及細(xì)胞損傷。

非酒精性脂肪肝炎；蘆薈大黃素；細(xì)胞模型；細(xì)胞損傷

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確的肝損傷因素引起的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪病變?yōu)橹饕卣鳎愿螌?shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪貯積和脂肪變性為特征的臨床病理綜合征。NAFLD疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）和潛在的肝硬化［1］。NASH是指肝組織病理學(xué)變化與酒精性脂肪性肝炎相似，但無(wú)明確飲酒史的一種獲得性代謝疾病［2］。

蘆薈大黃素（aloe-elodin，AE）是蘆薈的主要瀉下成分之一。Arosio等［3］研究發(fā)現(xiàn)，AE對(duì)四氯化碳引起的小鼠急性肝損害有防護(hù)作用，不僅能阻止肝細(xì)胞死亡，還能防護(hù)脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。許丹等［4］通過(guò)制作血吸蟲(chóng)病性肝纖維化小鼠模型，利用AE治療，發(fā)現(xiàn)治療后病理程度和范圍均明顯減輕，肝組織丙二醛明顯減少，腫瘤生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和局部粘著斑激酶的表達(dá)均減少。據(jù)此，本研究擬探討AE對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用，以脂肪乳劑誘導(dǎo)體外NASH細(xì)胞模型，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛、內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等指標(biāo)，了解肝細(xì)胞損傷程度，并設(shè)平行實(shí)驗(yàn)組予以不同濃度AE干預(yù)受損肝細(xì)胞，檢測(cè)培養(yǎng)液中上述指標(biāo)濃度，研究AE對(duì)損傷肝細(xì)胞修復(fù)以及對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響。

1 材料與方法

1．1 材料

人健康肝細(xì)胞株L-02購(gòu)自中科院細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)，改良RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（新西蘭進(jìn)口）購(gòu)自北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，30%中長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液購(gòu)自華瑞制藥有限公司，細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海碧云天公司，油紅O試劑、T4424胰酶為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，98%AE購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司，三酰甘油、AST、ALT試劑盒均為羅氏公司產(chǎn)品，SOD、丙二醛、內(nèi)毒素及TNF-αELISA試劑盒購(gòu)自南京建成公司，顯微鏡為奧林巴斯DP72，CO2恒溫箱為三洋MCO-15AC，Biobase超凈工作臺(tái)。

1．2 方法

1．2．1 肝細(xì)胞培養(yǎng) 將人正常肝細(xì)胞株L-02接種于培養(yǎng)瓶，用含100 mL／L小牛血清、青鏈霉素各10 U／L的RPMI 1640培養(yǎng)，待細(xì)胞融匯至80%時(shí)，用0．25%EDTA胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

1．2．2 NASH離體細(xì)胞模型的建立 參照本實(shí)驗(yàn)室既往NASH模型建立方法［5］，并加以改進(jìn)。將離體培養(yǎng)的肝細(xì)胞接種于6孔板，行細(xì)胞爬片培養(yǎng)，設(shè)空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。空白對(duì)照組用正常1 640培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組按照培養(yǎng)基中含30%脂肪乳劑濃度不同分4組：0．25 mL／L組，0．5 mL／L組，0．75 mL／L組，1．0 mL／L組。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至70%左右時(shí)，用含脂肪乳劑的培養(yǎng)基干預(yù)，于24、48、72 h分別行油紅O染色。具體方法：將載玻片常溫干燥10 min，75%乙醇孵育10 s，油紅O染色工作液避光孵育10～15 min，再用75%乙醇分化數(shù)秒（至背景無(wú)色），水洗2min，蘇木素復(fù)染10min，水洗，鹽酸乙醇分化，用紙巾吸去周邊水分，觀察脂滴數(shù)量，細(xì)胞形態(tài)，并于72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)液，檢測(cè)培養(yǎng)液中ALT、AST含量。

以最低脂肪乳劑濃度致肝細(xì)胞脂肪變性，并有ALT、AST升高，細(xì)胞狀態(tài)良好為原則，選擇最佳濃度（0．5 mL／L）建立NASH模型。

1．2．3 AE干預(yù)NASH細(xì)胞模型 在上述NASH細(xì)胞模型建立基礎(chǔ)上分5組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別為空白對(duì)照組（1640正常培養(yǎng)基），NASH模型組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即NASH模型組＋AE，AE終濃度分別為10－4、10－5、10－6mmol／L；每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行組，分別于培養(yǎng)24、48、72 h測(cè)上清液中ALT、AST、SOD、丙二醛、內(nèi)毒素、TNF-α含量。

1．2．4 細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST、SOD、丙二醛、TNF-α、內(nèi)毒素檢測(cè) 分別于培養(yǎng)24，48，72 h收集6孔板中各濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液，AST、ALT的檢測(cè)按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)加樣后，由全自動(dòng)生化分析儀自動(dòng)檢測(cè)并計(jì)算結(jié)果。培養(yǎng)液低溫離心后，SOD、丙二醛、TNF-α、內(nèi)毒素的含量采用ELISA法檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒指示說(shuō)明進(jìn)行操作。

1．2．5 肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量檢測(cè) 待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右時(shí)分別予正常1640培養(yǎng)基、0．5 mL／L脂肪乳劑培養(yǎng)基、不同濃度的AE（10－4、10－5、10－6mmol／L）培養(yǎng)；每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行組，第3天離心，收集肝細(xì)胞，用250μL裂解液裂解，再次離心后由全自動(dòng)生化分析儀自動(dòng)檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的含量。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2．1 NASH模型中細(xì)胞的形態(tài)

細(xì)胞培養(yǎng)72 h，油紅O染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞邊緣清晰，呈鋪路石樣多角形排列，核大，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)紅色脂滴。0．25 mL／L組肝細(xì)胞形態(tài)基本同對(duì)照組，胞質(zhì)內(nèi)微量脂滴。0．5 mL／L組細(xì)胞邊緣清晰，大部分細(xì)胞變圓，細(xì)胞間結(jié)合欠緊密；細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴較多，部分細(xì)胞內(nèi)脂滴成環(huán)狀位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，可見(jiàn)較大的脂滴。0．75 mL／L組有部分細(xì)胞破裂，細(xì)胞間結(jié)合不緊密，細(xì)胞內(nèi)脂滴較多較大，偶見(jiàn)較多脂滴將細(xì)胞核擠向一側(cè)，呈印戒樣改變。1．0 mL／L組細(xì)胞較稀疏，較多細(xì)胞破裂，染色后見(jiàn)脂滴更大，脂肪堆積更明顯，可見(jiàn)脂滴片狀融合，泄漏于胞外。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇0．5 mL／L作為致肝細(xì)胞脂肪變性最佳濃度。見(jiàn)圖1。

2．2 不同濃度脂肪乳劑培養(yǎng)基作用后細(xì)胞上清液中ALT、AST的含量變化

細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞上清液中ALT、AST含量較對(duì)照組明顯升高，其中以0．5 mL／L組升高最為明顯，0．75 mL／L組及1．0 mL／L組由于脂肪乳劑濃度太高，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，致細(xì)胞上清液中ALT、AST的升高無(wú)0．5 mL／L明顯，見(jiàn)圖2。故選用0．5 mL／L濃度建立NASH肝細(xì)胞模型。

2．3 不同濃度AE干預(yù)后NASH模型細(xì)胞中各檢測(cè)指標(biāo)含量的變化

AE干預(yù)NASH模型后，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，10－4mmol／L AE組及10－5mmol／L AE組細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST含量均較模型組明顯降低，10－6mmol／L AE組較模型組無(wú)明顯降低。隨著脂肪乳劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組細(xì)胞上清液中丙二醛含量明顯增加，SOD含量明顯降低。隨AE濃度增加，細(xì)胞上清液中丙二醛含量下降，SOD含量增加，呈一定的濃度時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，其中10－4mmol／L AE組作用72 h抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用最明顯。此外，AE各組細(xì)胞上清液中TNF-α、內(nèi)毒素的含量明顯低于模型組，且同一時(shí)間點(diǎn)AE的濃度越高，含量越低，其中以10－4mmol／L AE組作用72 h抗炎效果最佳。見(jiàn)圖3。

2．4 不同濃度AE干預(yù)NASH細(xì)胞模型后三酰甘油含量變化

細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，各AE濃度組肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的含量較模型組明顯降低，且AE濃度越高，抗脂質(zhì)沉積的作用越強(qiáng)。見(jiàn)圖4。

3 討論

在過(guò)去的10年中，NAFLD發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，已成為全球慢性肝病最常見(jiàn)的疾病之一［6－7］。西方國(guó)家患病率約20%～34%，為肝酶異常的首要原因［8－9］，我國(guó)患病率為15%～20%，40歲以上男性患病率高達(dá)30%，且近年來(lái)呈年輕化趨勢(shì)［10］。NAFLD病理上表現(xiàn)為單純的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積或伴有不同程度的壞死性炎癥和可能存在的纖維化［6－7，11－12］。NASH病理表現(xiàn)為肝臟細(xì)胞的氧化損傷，炎癥和活化纖維形成［13－14］。目前，關(guān)于NAFLD發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制尚不清楚［15－16］，有假說(shuō)認(rèn)為，NAFLD是由于輸送到肝臟的游離脂肪酸增多，肝細(xì)胞脂肪酸代謝紊亂，或從頭合成增加，致三酰甘油在肝細(xì)胞內(nèi)堆積所引起［17］。最新研究表明，NAFLD是一種復(fù)雜的多因素疾病，其發(fā)生、發(fā)展由多種因素共同作用，包括主體因素（基因多態(tài)性）、環(huán)境因素以及生活方式（如飲食習(xí)慣）等。其中，基因多態(tài)性主要與機(jī)體氧化應(yīng)激、炎癥和先天免疫反應(yīng)的差異相關(guān)［11，18］，這些因素的綜合作用促進(jìn)了非酒精性脂肪肝的形成及進(jìn)一步向NASH發(fā)展［15］。故建立NAFLD和NASH體外細(xì)胞模型對(duì)研究NAFLD和NASH的發(fā)病機(jī)制及防治具有重要的理論意義與廣泛的實(shí)用價(jià)值。

目前對(duì)于酒精性脂肪肝以及NASH的研究多見(jiàn)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但動(dòng)物模型存在個(gè)體差異較大、實(shí)驗(yàn)條件不易控制、外界影響因素多、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等不利因素。因此，本研究采用NASH細(xì)胞模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可最大限度減少個(gè)體差異和其他外界因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，并可直觀肝細(xì)胞脂肪變性的過(guò)程以及肝細(xì)胞損傷。根據(jù)NAFLD的發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用加入不同濃度脂肪乳劑的培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細(xì)胞，短期內(nèi)即可致肝細(xì)胞累積大量三酰甘油，并伴有ALT、AST升高，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂越明顯，形成體外脂肪肝模型。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中脂肪乳劑濃度過(guò)低或過(guò)高均不利于建立NASH模型，過(guò)低對(duì)肝細(xì)胞影響較小，過(guò)高除影響觀察視野外，還會(huì)造成細(xì)胞大量死亡，這可能與細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高及脂肪毒性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)在肝細(xì)胞脂肪變性基礎(chǔ)上繼續(xù)予以含脂肪乳劑培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)后測(cè)得培養(yǎng)液中ALT、AST、丙二醛，TNF-α，內(nèi)毒素含量增加，SOD含量下降，細(xì)胞損傷加重，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)上述變化越明顯，模擬出體內(nèi)過(guò)氧化物增多引發(fā)的二次打擊導(dǎo)致NASH的發(fā)病過(guò)程，成功建立NASH細(xì)胞模型；AE干預(yù)結(jié)果顯示，AE可抑制培養(yǎng)液中ALT、AST、丙二醛，TNF-α，內(nèi)毒素含量增加及SOD含量下降，其抑制作用與AE濃度相關(guān)。與模型組相比，AE各組細(xì)胞損傷減輕，隨AE濃度升高，作用越明顯，由此可見(jiàn)，AE對(duì)NASH細(xì)胞模型具有明顯的保護(hù)作用，從細(xì)胞水平證明AE能改善NASH的炎性反應(yīng)及脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

本實(shí)驗(yàn)在成功建立NASH離體細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，從細(xì)胞水平觀察不同濃度AE對(duì)NASH細(xì)胞模型脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和炎癥反應(yīng)的影響。當(dāng)然，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性，例如，不可避免地存在細(xì)胞凋亡及實(shí)驗(yàn)操作對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響，需要反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)，增加細(xì)胞培養(yǎng)量以減少誤差。此外，加入AE的濃度及檢測(cè)各數(shù)值的時(shí)間截點(diǎn)，均有待于進(jìn)一步摸索和完善。

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Effect of aloe-elodin on non-alcoholic steatohepatitis cellsmodel

DAINa1，ZHOU Pei2，ZHANG Yin-yin3，WANG Bin-fang1
（1．Department of Gastroenterology，the Affiliated Kunshan Hospital of Jiangsu University，Kunshan Jiangsu 215300；2．Graduate School of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To study the effect of aloe-emodin（AE）on non-alcoholic steatohepatitis cell model．M ethods：Thirty percent fat emulsion were added into the culture medium cultured normal human liver cell line L-02，then the cellswere divided into control group and experiment groups in which culture medium containing 30%fat emulsion at different concentrations，which were 0．25ml／L，0．5 mL／L，0．75 ml／L，1．0 ml／L，respectively．After 72 hours culture，the cellswere stained by oil red O，then observed themorphology and the intracellular lipid droplets；and mesured the alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），triglyceride（TG）contents in liquid culture；choosed themostappropriate concentration of 30%fat emulsion（0．5 mL／L FA group）to establish the nonalcoholic steatohepatitismodel．Then the cellswere randomized into the control group，model group and experimental groups in which culturemedium the concentrations of aloe emodin were 10－4mmol／L，10－5mmol／L，10－6mmol／L，respectively．The number of intracellular lipid droplets，triglyceride contentand indicators of ALT，AST，superoxide dismutase（SOD），malonaldehyde（MDA），endotoxin，tumor necrosis factor-α（TNF-α）in culture medium were determined．Results：The model of NASH liver cells were successfully established．Three groupswere added with different concentration of AE intervention，after 72 hours，their ALT，AST，MDA，endotoxin，TNF-αin liquid culture decreased，SOD content increased compared with themodel group（P＜0．05）．Conclusion：AE could improve liver cell lipid peroxidation degree，and reduce inflammation andcell damage，which correlated positively with the time and concentration，within a given range．

non-alcoholic steatohepatitis；aloe-elodin；cellmodel；cell injury

R575．1

A

1671－7783（2014）06－0478－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140200

戴娜（1981—），女，江蘇昆山人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事非酒精性脂肪性肝炎的研究；王炳芳（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：shbingfang＠163．com

2014－07－08 ［編輯］ 劉星星