miRNA-34甲基化與卵巢癌臨床病理特征及預后的關系

邵佳，何愛琴*，張玉泉，劉繼斌

（1．南通大學附屬腫瘤醫院婦科，江蘇南通226361；2．南通大學附屬醫院婦科，江蘇南通226001；3．南通大學附屬腫瘤醫院研究所，江蘇南通226361）

miRNA-34甲基化與卵巢癌臨床病理特征及預后的關系

邵佳1，何愛琴1*，張玉泉2，劉繼斌3

（1．南通大學附屬腫瘤醫院婦科，江蘇南通226361；2．南通大學附屬醫院婦科，江蘇南通226001；3．南通大學附屬腫瘤醫院研究所，江蘇南通226361）

目的：探討miR-34a和miR-34b／c基因啟動子區甲基化水平與卵巢癌臨床病理特征的關系。方法：采用特異性甲基化PCR分別檢測80例卵巢癌患者卵巢癌組織及血漿中的miR-34a和miR-34b／c基因甲基化水平，分析其表達與臨床病理特征及預后之間的關系。結果：80例卵巢癌組織中有58例miRNA-34a甲基化陽性，血漿陽性31例；有69例miRNA-34b／c基因甲基化陽性，血漿陽性40例。聯合檢測血漿和組織miRNA-34甲基化具有一致性。miRNA-34基因甲基化與FIGO分期、淋巴結轉移有關（P＜0．05），與患者年齡、腫瘤有無包膜及病理類型無關（P＞0．05）。術后76例隨訪3年，有45例復發（59．21%），復發組癌組織和血漿miRNA-34甲基化陽性率分別為95．6%（43例）、62．2%（28例），明顯高于無復發病例組［77．4%（24／31）和35．5%（11／31），P均＜0．05］；發生轉移的36例患者癌組織和血漿miRNA-34甲基化率亦明顯高于無轉移組（40例）。結論：miRNA-34甲基化異常表達可作為晚期卵巢癌預后不佳的分子標志物。

卵巢癌；miRNA-34；甲基化；PCR

卵巢癌是女性生殖系統的三大惡性腫瘤之一，發病率占第3位，但是病死率卻位于第1位，預后較差。因此，尋找一種新的特異性強的分子標志物，對提高卵巢癌患者的生存率具有較高的臨床應用價值。目前認為，相關的miRNA在卵巢癌的發生、發展中起到了癌基因和抑癌基因的作用［1］。而miRNA基因甲基化可能是卵巢癌中miRNA異常表達的調控機制［2］。我們采用特異性甲基化PCR分別檢測了卵巢癌組織及血漿中的miRNA-34a（miR-34a）和miR-34b／c基因甲基化狀態，并分析了其表達與臨床病理特征之間的關系。

1 對象與方法

1．1 病例

80例患者為2009年1月至2010年12月南通大學附屬腫瘤醫院婦科收治的卵巢癌病例，年齡≤60歲29例，＞60歲51例。其中，54例有淋巴結轉移，38例腫瘤有包膜。參照FIGO（2009）分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期22例，Ⅲ期27例，Ⅳ期15例。手術方式：FIGOⅠ～Ⅱ期患者行全子宮＋雙附件＋大網膜＋闌尾＋盆腔、腹主動脈旁淋巴結清掃。FIGOⅢ～Ⅳ期病例行腫瘤細胞減滅術（均行后腹膜淋巴結活檢）。術后除了G1的ⅠA期和ⅠB期7例患者未補充化療外，其余患者均行6～8個療程的紫杉醇＋鉑類化療。術后均已隨訪和采集外周血、癌組織及癌旁組織；所有患者均簽署知情同意書。

1．2 方法

1．2．1 主要儀器與試劑 Eppendorf系列PCR儀（德國），實時定量熒光PCR系統（上海索萊寶生物科技有限公司），Bio-Rad凝膠成像分析儀（美國伯樂公司），Eppendorf全自動移液器（上海心亮實業有限公司），酶標儀（北京市六一儀器廠），DNA測序儀（深圳山奇山生物技術有限公司），微電腦全自動控制雷射顯微細胞組織擷取系統、CM3050S冰凍切片機（德國萊卡儀器有限公司），凝膠成像系統（北京市六一儀器廠），高速低溫落地式離心機、臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司），超凈工作臺（廣東上善尚德凈化科技有限公司）。

1．2．2 組織和血漿DNA提取 采用人類組織和細胞DNA提取試劑盒（德國）提取組織和血漿DNA。患者均晨起空腹抽取外周靜脈血（抗凝），組織標本在離體10min之內取材，液氮速凍5min后－80℃保存。

1．2．3 miRNA甲基化定量檢測 應用EZDNA甲基化試劑盒（美國Zymo公司）進行DNA變性及重亞硫酸氫鹽轉化。根據測序的結果設計miRNA特異性引物和探針，應用實時PCR法檢測miRNA甲基化水平。反應體系和條件參照試劑盒說明書進行，每個樣品都進行3次平行實驗，用Human CpGenome Universal Methylated DNA（Chemicon International，美國）作為陽性對照，雙蒸水作為陰性對照。具體步驟：①實驗前先將CT保存試劑混勻，將900 μL水、50μLM-溶解緩沖液以及300μL M-稀釋緩沖液加入到同一試管中。②將130μL的CT保存試劑與上步提取的DNA樣品20μL搖勻混合。③按照以下溫度程序進行操作：98℃10 min，64℃ 2．5 h，最后4℃存儲備用。④將660μL的M-鏈接緩沖液加入到Zymo-spin IC吸附柱，再加入樣品，密閉后再顛倒混合數分鐘。⑤10 000 r／min全速離心1min，去掉離心液。將20μL的M-去璜化緩沖液加入到吸附柱，再放置15～20 min。⑥10 000 r／min全速離心1 min。向吸附柱中加入200μL的M-漂洗緩沖液，多次重復此步驟。⑦直接加M-洗脫緩沖液10μL到吸附柱的基質，放置在1．5 mL試管中10 000 r／min離心2 min，分離出所需的DNA模板。miR-34甲基化引物序列見表1。

1．2．4 特異性甲基化PCR 甲基化PCR反應體系為2．5μL10×PCR緩沖液、2．0 mmol／L 4×dNTP混合物0．5μL、3μL引物、0．5μL的TaKaRaTM熱啟動Taq酶、25 mmol／L MgCl22μL以及模板3μL。甲基化擴增體系：95℃預變性12 min，隨后94℃15 s，共40個循環；55℃30 s，72℃40 s，再72℃延伸10 min。非甲基化擴增體系的退火溫度提升至56℃，其他步驟均相同。擴增產物為2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照射顯帶。RT-PCR：取1～2μL甲基化修飾型DNA進行PCR，擴增產物為2%瓊脂糖凝膠電泳，然后紫外光照射顯帶。

1．2．5 隨訪 統一制訂調查問卷和隨訪工作手冊，所有資料均由專人編碼，核查正確后雙軌錄入計算機。對全部病例每3個月隨訪1次，以是否復發、轉移或因卵巢癌死亡作為觀察終點。復發的評價指標是腫瘤病灶再次出現在原有位置，轉移的評價指標是腫瘤病灶脫離其原發部位，擴散到身體其他部位。

1．3 統計學方法

應用EpiData 3．1中文版軟件處理隨訪資料以及實驗數據，使用SAS 9．0軟件進行資料分析，組間比較運用χ2檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 卵巢癌患者血漿和組織中miR-34甲基化率

80例卵巢癌組織標本中檢測出miR-34a基因甲基化陽性58例，而血漿中miR-34a基因甲基化陽性31例。80例卵巢癌組織中miR-34b／c基因甲基化陽性69例，血漿中miR-34b／c基因甲基化陽性40例。

80例卵巢癌組織中，miR-34基因甲基化陽性達71例，血漿中miR-34基因甲基化陽性41例。2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，miR-34a和miR-34b／c基因成單一條帶。

2．2 卵巢癌miR-34甲基化與臨床病理特征的關系

我們對80例卵巢癌組織和血漿miR-34基因甲基化與患者年齡、腫瘤有無包膜、FIGO分期（2009）和病理類型的關系進行了分析。病理類型中，子宮內膜樣癌22例，漿液性癌31例，黏液性癌27例。結果顯示，miR-34基因甲基化率與FIGO分期相關（P＜0．05），有淋巴結轉移組無論是卵巢癌組織中還是血漿中的miR-34基因甲基化率均明顯高于無淋巴結轉移組，差異有統計學意義（P＜0．05）。同時發現miR-34基因甲基化與患者年齡、腫瘤有無包 膜及病理類型無關（P＞0．05）。見表2。

2．3 miR-34甲基化與卵巢癌復發轉移的關系

80例患者中有76例（95．0%）術后隨訪3年，發現卵巢癌復發45例，其中癌組織miR-34甲基化陽性43例（95．6%），血漿miR-34甲基化陽性28例（62．2%）。而未復發的31例患者中，癌組織miR-34甲基化陽性24例（77．4%），血漿miR-34甲基化陽性11例（35．5%），復發組無論是癌組織還是血漿miR-34甲基化率均明顯高于未復發組，差異均有統計學意義（χ2＝4．18和5．25，P均＜0．05）。

36例發生轉移的病例中癌組織miR-34甲基化陽性35例（97．2%），40例未轉移的病例中32例（80．0%）甲基化陽性，兩者差異有統計學意義（χ2＝3．86，P＜0．05）。轉移組血漿miR-34甲基化陽性24例（66．7%），亦明顯高于未轉移組（15例，37．5%），差異亦有統計學意義（χ2＝6．45，P＜0．05）。

3 討論

近年來，miRNA作為一類新的癌基因和抑癌基因逐步受到重視。miRNA可能參與了人類所有的生理及病理活動的調控。miRNA的轉錄過程由RNA聚合酶Ⅱ介導，而DNA甲基化是一種重要的使RNA聚合酶Ⅱ轉錄的基因表達沉默的表觀遺傳方式，因此DNA甲基化調控miRNA的表達。目前較多研究認為，DNA甲基化在腫瘤的發生、發展及預后判斷中發揮著重要作用。

微陣列芯片技術的應用使得組織中的miRNA表達譜檢測成為可能，雖然miRNA表達的變化和不同組織類型腫瘤的生物學之間的功能性聯系仍不是十分明朗，但miRNA的保守性及穩定性之高使其成為一種新的腫瘤標志物，具有較好的臨床應用前景。卵巢癌中部分miRNA表達升高，部分表達下降，因而miRNA的表達譜可以鑒別正常卵巢組織與良性、惡性卵巢腫瘤［3］，同時還可以區分原發性與繼發性卵巢癌［4］。在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌的致死率無疑是最高的，研究也較為深入。目前認為相關的miRNA在卵巢癌的發生發展中起到了癌基因和抑癌基因的作用。通常miRNA的DNA甲基化可分為高甲基化以及低甲基化。高甲基化即正常組織中不會發生甲基化的位點被甲基化，低甲基化則是在正常組織發生甲基化的位點上出現去甲基化現象。Lujambio等［5］研究發現，某些腫瘤中miRNA的高甲基化可通過去甲基化劑降低甲基化水平，使miRNA的表達重新上調，這表明miRNA的表達情況明顯受到了啟動子區CpG島甲基化的影響。Dahiya等［6］檢測15例正常卵巢組織、69例卵巢惡性腫瘤組織，發現正常組織與腫瘤組織中89%的miRNA表達水平不同，其中miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141表達增高，miR-140、miR-199a、miR-145及miR-125b1表達明顯下降。Iorio等［7］發現miR-21、miR-203以及miR-205在卵巢癌細胞中表達升高，而這三者正定位于DNA甲基化轉移酶作用的CpG島上。且這些miRNA在卵巢癌OVCAR3細胞株經5-Aza-CdR誘導后表達明顯升高，故推測其表達上調是由于DNA甲基化不足引起的，提示miR-21、miR-203以及miR-205的異常表達受DNA甲基化的調控，其致癌基因作用參與卵巢癌的發生發展。Let-7a-3是Let-7家族中的一員，是最早發現的miRNA之一，定位于CpG島。Kan等［8］發現Let-7a-3低甲基化引起胰島素樣生長因子Ⅱ表達異常，從而影響卵巢癌患者預后，而Let-7a-3高甲基化可明顯降低卵巢癌患者死亡風險［9－10］。Corney等［11］研究表明，在上皮性卵巢癌中，miR-34a、miR-34b／c變化最明顯，所有miR-34a的DNA甲基化樣本miR-34a表達均下調。57%的miR-34b、miR-34c甲基化樣本出現miR-34b、miR-34c的表達下調，用甲基化抑制劑處理后，miR-34a、miR-34b／c重新表達。2011年Vogt等［12］的研究結果與其基本相符，表明miR-34a、miR-34b／c的DNA甲基化與卵巢癌具有相關性。2012年Yang等［13］檢測了26例卵巢癌組織及5例卵巢良性腫瘤組織的DNA甲基化水平。結果發現miR-130b卵巢癌組織甲基化表達水平明顯高于良性卵巢腫瘤組織，且miR-130b在卵巢組織中的表達與其甲基化的水平顯著負相關。細胞水平研究顯示，耐藥細胞株中的miR-130b甲基化水平遠遠高于親本株。予去甲基化藥物處理后，miR-130b的甲基化水平明顯下降，其表達水平顯著上升，從而推斷miR-130b的表達受甲基化調控，去甲基化可部分逆轉卵巢癌細胞耐藥。上述研究表明miRNA的DNA甲基化具有一定的腫瘤特異性，與卵巢癌的發生發展密切相關。

此外，關于miRNA的DNA甲基化與其他惡性腫瘤之間的關系也有較多報道。Roman-Gomez等［14］的研究提示miRNA甲基化是急性淋巴細胞性白血病預后的獨立預測因素。Hildebrandt等［15］研究發現，miR-9-1和miR-9-3在腎透明細胞癌組織中特異性超甲基化，且這兩個基因的高甲基化水平可顯著降低腎細胞癌患者的無復發生存期。

目前臨床上較多采用的是將血清CA125作為卵巢癌病情的評價指標，但是CA125有一定的局限性，其特異性不強，在盆腔炎、卵巢巧克力囊腫等良性疾病中也會升高。因此，尋找一種新的特異性強的分子標志物很有必要。miRNA甲基化的研究目前還處于初級階段，人們對miRNA調控機制的認識仍較淺顯。本研究發現隨訪的76例卵巢癌患者中，miR-34甲基化與卵巢癌復發、轉移有一定的關系，血漿中miR-34甲基化狀態可用來監測卵巢癌病情的發展，并可指導臨床治療。但因本研究樣本量有限，結論是否符合臨床實際，仍需大樣本量的臨床驗證以及長期的隨訪調查。

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R737．31

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1671－7783（2014）06－0513－04

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*：通訊作者，E-mail：8717717＠qq．com

2014－09－21 ［編輯］ 陳海林