結直腸癌病人腸道黏膜菌群結構的變化

李毅，王驥平，李宇，曹守根，姚增武，周巖冰

(1 青島大學附屬醫院普外科，山東 青島 266003； 2 青島市市立醫院東院急診外科； 3 煙臺市煙臺山醫院)

人體胃腸道蘊藏著一個復雜而豐富的微生物群落，在結腸中含有高達1013～1014的微生物[1]。這些微生物對宿主的營養和黏膜免疫方面有至關重要的作用，如代謝某些食物和藥物成分、調節人體免疫應答、抵御外來病源侵害，等等[2-3]。已知胃癌和宮頸癌分別由幽門螺旋桿菌和人類乳頭狀瘤病毒所導致[4-5]。隨著第二代測序技術的發展，許多研究顯示，腸道菌群在結直腸癌(CRC)的發展中起到重要作用[6]。本研究采用第二代高通量焦磷酸測序技術，分析 CRC病人腸道菌群結構的變化，探討CRC診斷與治療的新方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

我院住院的CRC病人50例，男25例，女25例；年齡41～80歲；體質量指數19.7～28.6。病人既往無結直腸手術史；無慢性腸道疾病、代謝性疾病、感染性疾病；術前未行放化療治療；手術前3個月內沒有應用糖皮質激素、抗生素以及其他的非甾體抗炎藥物。手術標本在進行病理組織學檢查后按TNM分期進行分類。癌組織和癌旁正常組織(距癌組織8～10 cm)在手術期間收集。所有標本立即用液氮快速冰凍然后儲存在-80 ℃冰箱內。病人均知情同意。

1.2 細菌DNA提取

糞便細菌基因組DNA通過DNA提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit(德國Qiagen公司生產)進行提取。將樣品中加入酶裂解緩沖液、溶菌酶和消色肽酶，并在37 ℃下反應1 h。然后，加入蛋白酶K和裂解緩沖液AL，并將懸浮液置于56 ℃下反應30 min。最后，將基因組DNA通過核酸純化柱進行純化并洗脫。所提取的基因組DNA的濃度通過量子比特熒光計(美國Invitrogen公司生產)測定，DNA的質量通過瓊脂糖凝膠電泳測定。提取的基因組DNA儲存在-20 ℃冰箱中。DNA提取均由中國深圳華大基因研究院專業人士完成。

1.3 PCR擴增和測序

使用通用引物(907F5′-CCGTCAATTCMTTT-GAGTTT-3′，338R5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)進行細菌的16S rDNA序列的V3-V5區域的PCR擴增。參數如下：95 ℃預變性2 min；然后95 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，共25個循環；最后72 ℃延伸7 min。焦磷酸測序使用GS FLX Titanium XLR70測序試劑盒，在454高通量測序平臺(羅氏)上進行測序，測序工作由中國深圳華大基因研究院完成。

1.4 生物學分析

首先將測序得到的原始序列進行非冗余處理，然后將非冗余的序列進行物種注釋并聚類成操作分類單元(OTU)，然后通過OTU注釋完成物種的分類。使用Mothur(V.1.31.2，http://www.mothur.org/)軟件將樣品獨特序列與RDP數據庫(http://www.mothur.org/wiki/RDP_reference_files)比對，進行物種注釋，一個OTU中包含的獨特序列51%以上都注釋為同一物種，則該OTU即注釋為該物種，達不到51%的標準，則在上一個物種分類等級再進行OTU對應物種分析，得到該樣品的物種組成信息，然后將每個OTU內所含的獨特序列數進行統計，結合物種組成信息結果，得到每個物種在該樣品中的豐度。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統計處理。兩組樣本數據間比較采用Mann-Whitney檢驗，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 序列多樣性分析

本文100個樣本共得到1 032 723條高質量序列，平均每個樣本含10 327條序列；在97%相似度水平上共得到12 115個OUT，平均每個樣本含121個OUT。在當前測序深度下，稀疏曲線和Shannon指數幾乎趨于穩定，表明大部分物種和多樣性已經被檢測到。

2.2 兩種組織菌群結構在門水平上的比較

癌組織和癌旁正常組織中優勢菌門相同，均為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門和放線菌門。在CRC的癌組織中，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門和放線菌門分別占35.34%、33.84%、14.79%、13.62%和0.94%；在癌旁正常組織中分別占37.53%、39.96%、15.27%、2.30%和2.51%。癌組織中梭桿菌門明顯高于癌旁正常組織(Z=3.63，P<0.001)。

2.3 兩種組織菌群結構在屬水平上的比較

在屬水平上，測序結果顯示癌組織有172個屬，癌旁正常組織有159個屬，擬桿菌屬在兩組中均為豐度最高的菌屬，分別占22.38%和21.25%，但兩組間比較差異無統計學意義。存在顯著性差異的菌屬為梭桿菌屬、彎曲菌屬、Faecalibacterium和羅氏菌屬，在癌組織中分別占12.08%、0.02%、1.94%和0.46%；在癌旁正常組織中分別占1.96%、0.01%、6.14%和2.42%。梭桿菌屬、彎曲菌屬在癌組織中的豐度與癌旁正常組織相比明顯降低，而Faecalibacterium、羅氏菌屬豐度明顯升高，差異有顯著意義(Z=1.84～3.63,P<0.05)。

3 討 論

腸道菌群對于維持宿主腸道乃至全身的正常代謝功能和健康狀態具有非常重要的意義[7-8]。本研究應用454焦磷酸測序技術檢測了CRC病人癌組織和癌旁正常組織菌群結構的變化，結果顯示，癌組織菌群結構較周圍正常組織發生了明顯改變，出現了有害的條件致病菌增加、有益的細菌減少的結構失調現象。

腸道炎癥一直被稱為腸癌的危險因素[9]。而在本項研究中梭桿菌屬和彎曲菌屬在癌組織中明顯增多。梭桿菌屬是一種具有侵入性和促炎的革蘭陰性厭氧菌，而大量研究也表明，梭桿菌參與了炎癥性腸疾病的發展[10]；彎曲菌屬中被研究最多的是空腸彎曲菌，是目前公認的急性腹瀉和胃腸炎的主要病原菌[11]。因此，梭桿菌屬和彎曲菌屬可能通過引起腸道炎癥導致腸道微環境發生改變，促進腫瘤發生，但其促癌的具體機制還需要進一步研究。

Faecalibacterium和羅氏菌屬均為丁酸產生菌，通常被認為是益生菌微生物[12]。因為丁酸鹽可以通過保護腸道上皮細胞的完整性、調節腸道免疫應答、抑制腫瘤細胞生長、降低促致癌酶的活性等機制，從而能夠保護宿主腸壁，降低腸道炎癥及CRC發生的風險[13]。因此，這些有益細菌的減少可能是導致CRC發生的間接原因。

綜上所述，本研究通過焦磷酸測序技術研究了CRC病人腸道菌群的相關變化，結果出現了有害的條件致病菌增加、有益細菌減少的結構失調現象，這為CRC的診斷和治療提供了新思路。然而，腸道菌群變化促癌的確切機制仍不清楚，因此需要更多的研究以探討CRC發生腸道菌群失調的機制。

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