PD-L1抑制同種淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)研究

文 雪

（湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，湖北 孝感432000）

目前已證實(shí)I型糖尿病和自身免疫耐受缺失有關(guān)，自身反應(yīng)性T細(xì)胞在I型糖尿病的免疫發(fā)病機(jī)理中起主導(dǎo)作用[1]。移植胰島細(xì)胞治療I型糖尿病是一個具有前景的治療策略，然而自身反應(yīng)性T細(xì)胞的存在是胰島移植治療I型糖尿病方法中最大的障礙。程序性死亡分子配體-1（PD-L1）和程序性死亡分子配體-2（PD-L2）已被證實(shí)為PD-1的配體[2]。由于PD-L1在非淋巴組織的表達(dá)提示PD-L1可以調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性T細(xì)胞或B細(xì)胞，同時（或者）調(diào)節(jié)靶器官的炎癥反應(yīng)。有研究表明，PD-L1信號可以介導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡，在腫瘤細(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)攻擊中起重要的作用。通過抗體阻斷PD-1：PD-L1這條通路可促進(jìn)NOD鼠糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[3]。本實(shí)驗(yàn)在前期構(gòu)建PD-L1表達(dá)載體和初步研究其功能的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究PD-L1對同種淋巴細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，通過建立穩(wěn)定表達(dá)PD-L1胰島細(xì)胞株，觀察PD-L1對同種淋巴細(xì)胞增殖的影響，為PD-L1修飾胰島細(xì)胞移植重建糖尿病患者胰島細(xì)胞功能研究提供新的策略。

1 材料

NIT-1細(xì)胞株（小鼠胰島β細(xì)胞株）由澳大利亞WEH1實(shí)驗(yàn)室惠贈，本室傳代培養(yǎng)與保種。pEGFP-N1-PD-L1質(zhì)粒含有表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）基因序列，由本科室構(gòu)建。陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，抗體、CFSE購于美國BD公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 轉(zhuǎn)染PD-L1基因的NIT-1細(xì)胞穩(wěn)定子篩選

根據(jù)Lipofectamine2000TM試劑說明書進(jìn)行。將NIT-1細(xì)胞轉(zhuǎn)種于24孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞達(dá)到50～80%的融合；用無血清培養(yǎng)基分別溶解pEGFP-N1/pEGFP-N1-PD-L1和脂質(zhì)體，將脂質(zhì)體與核苷酸混合，室溫下靜置30min后，在24孔板中加入以上混合液，輕混；培養(yǎng)6h后棄轉(zhuǎn)染液，加入完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀檢測GRP78的表達(dá)。

2.2 CFSE染色檢測PD-L1修飾NIT細(xì)胞對同種淋巴細(xì)胞增殖影響

將Balb/c小鼠頸椎脫位處死，無菌取脾臟制備成脾淋巴細(xì)胞懸液，加入CFSE（2μmol/L）染色 ，調(diào)整細(xì)胞濃度作為同種反應(yīng)淋巴細(xì)胞備用。用0.25%胰酶消化NIT、NIT-PD-L1和NIT-EGFP細(xì)胞，洗滌后用DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，加入無菌絲裂霉素C（終濃度為30μg/ml），調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度作為刺激細(xì)胞備用。將Balb/c小鼠脾細(xì)胞懸液（反應(yīng)細(xì)胞）分別加入24孔培養(yǎng)板中，每孔5×106個細(xì)胞；將刺激細(xì)胞分別加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔5×105個細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)分組：① NIT-PD-L1+淋巴細(xì)胞；②NIT-EGFP+淋巴細(xì)胞；③NIT+淋巴細(xì)胞。反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞懸液培養(yǎng)7天后FCM測定淋巴細(xì)胞增殖。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)NIT-1細(xì)胞中EGPF或PD-L1的表達(dá)

pEGFP-N1和pEGFP-N1-PD-L1表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染NIT-1細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，經(jīng)FCM檢測EGPF和PD-L1的表達(dá)。結(jié)果顯示：對照組（NIT）EGPF表達(dá)率為0，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染NIT細(xì)胞組EGPF表達(dá)率為 87.2%±5.6，pEGFP-N1-PD-L1 轉(zhuǎn) 染 NIT 細(xì) 胞組 EGPF 表 達(dá)率 為88%±6.8； 對照組 （NIT）PD-L1 表達(dá)率為 5.4%±0.8，pEGFP-N1 轉(zhuǎn)染NIT 細(xì)胞組 PD-L1 表達(dá)率為 4.8%±1.5，pEGFP-N1-PD-L1 轉(zhuǎn)染 NIT細(xì)胞組 PD-L1 表達(dá)率為 90%±5.3（P＜0.01）。

3.2 PD-L1可顯著抑制同種淋巴細(xì)胞增殖

CFSE染色流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：NIT-PD-L1+淋巴細(xì)胞組增殖指數(shù)為（4.5±1.6）；NIT-EGFP+淋巴細(xì)胞組增殖指數(shù)為（9.1±2.1）；NIT+淋巴細(xì)胞組增殖指數(shù)為（8.5±3.1）。 結(jié)果說明 PD-L1 可以抑制同種淋巴細(xì)胞增殖，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

4 討論

PD-L1是正性或負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體（TCR）介導(dǎo)的信號通路B7家族成員之一[4]。一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在非肥胖糖尿病（NOD）小鼠，體內(nèi)應(yīng)用拮抗的單克隆抗體（mAb）阻斷B7-H1可以活化效應(yīng)T細(xì)胞，結(jié)果促進(jìn)了自身免疫性糖尿病的發(fā)生發(fā)展，在半抗原誘導(dǎo)的小鼠接觸性過敏反應(yīng)模型或?qū)嶒?yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型中，B7-H1基因敲除同樣促進(jìn)了自身免疫性疾病的、發(fā)生發(fā)展[5-6]。以上結(jié)果說明，PD-L1在同種免疫應(yīng)答中的重要負(fù)性調(diào)節(jié)功能。本實(shí)驗(yàn)以PD-L1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染NIT-1細(xì)胞作為體外細(xì)胞模型，研究PD-L1的負(fù)性調(diào)節(jié)功能。從細(xì)胞混合培養(yǎng)結(jié)果可以看出，PD-L1抑制淋巴細(xì)胞的增殖，提示PD-L1抑制反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的活化。本實(shí)驗(yàn)證明PD-L1對同種免疫應(yīng)答具有負(fù)性調(diào)節(jié)功能，并初步探討了其機(jī)制，對于誘導(dǎo)并維持免疫耐受具有一定作用。

［1］Atkinson MA,Kaufman DL,Campbell L,et al.Response of peripheral-blood mononuclear cells to glutamate decarboxylase in insulin-dependent diabetes[J].Lancet,1992：339,458.

［2］Freeman GJ,Long AJ,Iwai Y,et al.Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation[J].J.Exp.Med.,2000：192,1027.

［3］Ansari MJ,Salama AD,Chitnis T,Smith RN,Yagita H,Akiba H,Yamazaki T,Azuma M,Iwai H,Khoury SJ,Auchincloss H Jr,Sayegh MH.The Programmed Death-1 (PD-1)Pathway Regulates Autoimmune Diabetes in Nonobese Diabetic(NOD)Mice[J].J Exp Med.,2003：63,69.

［4］Chen L.Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity[J].Nat Rev Immunol,2004,4：336-47.

［5］Dong H,Strome SE,Salomao DR et al.Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis：a potential mechanism of immune evasion[J].Nat Med.,2002,8：793-800.

［6］Latchman YE,Liang SC,Wu Y et al.PD-L1-deficient mice show that PD-L1 on T cells,antigen-presenting cells,and host tissues negatively regulates T cells[J].Proc Natl Acad Sci.USA,2004,101：10691-6.