殼寡糖對刺參生長、免疫反應和抗病力的影響＊

韓麗蓉，徐 瑋，汪東風，王艷龍

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島266003）

刺參（Apostichopusjaponicus）又稱仿刺參，習慣上稱為海參，隸屬于棘皮動物門，海參綱，楯手目，刺參科，仿刺參屬[1]，具有很高的經濟、藥用和醫用保健價值[2－3]。隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強，對刺參的需求不斷增加，從而引發了刺參的過度捕撈，導致刺參自然資源瀕臨枯竭[4]。為解決需求與資源的矛盾，刺參的人工養殖技術應運而生，并迅速發展，成為我國繼中國對蝦、扇貝后的又一大養殖品種。然而刺參的大規模無序養殖誘發了刺參病害孽生，嚴重制約著該產業的健康和可持續性發展[5－6]。而化學藥品和抗生素的過量濫用帶來了環境污染，造成了食品安全隱患，破壞了刺參的內穩定和自身免疫反應。因此，尋找安全、有效、健康的免疫增強劑勢在必行。

刺參隸屬于棘皮動物，與其他無脊椎動物一樣，刺參缺乏特異性免疫系統，關鍵防御機制受細胞免疫應答和非細胞的體液應答調節[7]，依賴天然免疫機制對進入動物體的異物進行識別、排除，或使異物變成無害物質，以及傷口修復等[8－10]。因此，通過有效途徑提高體腔細胞的活性，對提高刺參免疫反應具有重要的意義。

殼聚糖是甲殼素經脫乙酰化處理后的產物，具有廣譜抗菌和促生長的作用，作為飼料添加劑，已經廣泛應用于異育銀鯽（Carassiusauratusgibelio）、羅非魚（Tilapianilotica）、大黃魚（Pseudosciaenacrocea）、真鯛（SparusaurataL.）等。殼寡糖是殼聚糖降解后的產物，由2～10氨基葡萄糖通過β－1，4－糖苷鍵連接而成，分子量＜5 000，具有促進腸道菌群增值[11]、調節免疫反應[12－13]、抗氧化[14－15]等提高水產動物免疫反應以及抗病力的作用[16－17]。然而其在刺參養殖中的應用研究卻鮮有報道。

本實驗以刺參為對象，通過在飼料中添加殼寡糖來研究其對刺參生長、免疫反應和抗病力的影響，以期為刺參免疫增強劑的開發和應用提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以馬尾藻、魚粉、面粉、豆粕等為基礎原料，配制成粗蛋白含量22.58%，粗脂肪含量2.48%的基礎飼料（見表1）。在基礎飼料中加入0、0.25%、0.50%、1.00%和2.00%的殼寡糖制成實驗飼料。原料均過100目篩，混勻后加入水制成面團，用雙螺旋擠壓機（F－26（Ⅱ）華南理工大學）擠壓稱直徑為1mm的顆粒，在鼓風干燥器中44℃烘干，烘干的飼料粉碎后過篩，取40～80目中間顆粒作為實驗用飼料，密封保存。

殼寡糖由大連化學物理研究所提供，分子量＜1 000，純度＞97%。

1.2 樣品的養殖、采集與處理

所用刺參購自山東省青島市田橫刺參育苗場。在循環水系統中暫養2周，暫養期間飼喂基礎飼料。暫養結束后，隨機分組，每個處理設4個重復，每個重復18頭刺參（5.28±0.03）g。養殖試驗在中國海洋大學鰲山衛基地室內水族箱中進行，水族箱體積為60L。飼養期間連續充氣，水溫（16±1）℃，鹽度29.0±1.0，pH＝8.0±0.3。每天早晚各投喂1次，飽食投喂，并吸底排污1次，進行8周的養殖試驗。

8周養殖試驗結束后，對刺參饑餓24h，然后計數、稱重。對每個重復隨機取4頭刺參，解剖取其體腔液，吸取抗凝劑（0.02mol/L EGTA，0.48mol/L NaCl，0.019mol/L KCl，0.068mol/L Tris－HCl，pH＝7.6），與體腔液1：1混合，得到抗凝體腔液?？鼓w腔液一部分直接用于體腔細胞計數、吞噬活性和呼吸爆發活力的測定；另一部分離心10min（3 000×g，4℃）后，棄去上清，所得的體腔細胞沉淀用等體積預冷的生理鹽水重新懸浮。懸液用超聲波（22kHz，25×6s，0℃）破碎后，4 000×g離心10min（4℃），所得上清液即為體腔細胞破碎上清液（CLS），CLS用于一氧化氮合酶活力、超氧化物歧化酶活和酸性磷酸酶（ACP）活力的測定。

1.3 攻毒試驗

生長實驗8周結束后，隨機從每缸中抽取9頭刺參進行攻毒實驗。攻毒實驗所用菌株為燦爛弧菌（Vibrio splendidu），由中國水產科學研究院黃海水產研究所提供，是刺參“腐皮綜合征”主要致病菌[6]。燦爛弧菌用胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB），28℃下培養24h，然后用無菌生理鹽水沖洗菌落，并將濃度調整至1×108CFU/mL。攻毒實驗前首先通過預實驗確定刺參7d的半致死濃度LD50為1×107CFU/mL。每頭刺參經腹腔注射0.1mL菌液。對刺參進行2周的死亡情況觀察，最后計算刺參2周內的累積死亡率。

1.4 樣品的分析測定

1.4.1 特定生長率 特定生長率計算公式如下：

特定生長率（SGR）＝ （lnWt－lnW0）×100/t，其中：Wt為刺參終末體重；W0為刺參初始體重；t為養殖實驗的天數（56d）

1.4.2 體腔細胞計數 取50μL刺參體腔液加入到150μL戊二醛固定液中，利用血球計數板在10×40倍光學顯微鏡下直接計數，計算出刺參體腔細胞的密度。

1.4.3 吞噬活性的測定 吞噬活性采用吞噬中性紅的方法進行測定[18－20]，并略有改動。取100μL刺參體腔細胞抗凝液加入到96孔板中，貼壁30min后，棄上清，然后加入100μL 0.001mol/L的中性紅溶液，待體腔細胞吞噬中性紅30min后，再用生理鹽水輕輕洗去未被體腔細胞吞噬的中性紅。加入100μL細胞裂解液（冰醋酸∶無水乙醇＝1∶1，v/v），對刺參體腔細胞裂解20min后，在96孔板中加入細胞裂解液裂解20 min，用全波長酶標儀540nm下測定吸光值（OD540），以實驗條件下每106個體腔細胞的吸光值表示刺參體腔細胞的吞噬能力。

1.4.4 呼吸爆發活力的測定 參考Song和Hsieh方法[21]，略有改動。在96微孔板中先加入50μL 0.2%多聚賴氨酸（Poly－L－lysine，Sigma）增加96孔板的吸附能力，然后加入100μL抗凝刺參體腔液，離心10min（300×g，4℃），去除上清，然后加入100μL（1μg/mL）PMA （Phorbol myristate acetate，Sigma），溫育30min（37℃），然后加入100μL 0.3%NBT（Nitroblue tetrazolium，Sigma），在37℃下，溫育30min后，經離心10min（560×g，4℃），去除上清后加入200 μL 100%純甲醇終止反應（10min），經離心10min（700×g，4℃），去除上清，再用70%甲醇反復洗滌3次，離心去除上清，于室溫下晾干。干燥后，加入120 μL 2mol/L KOH 和140μL DMSO（二甲基亞砜），充分溶解孔內物質；在酶標儀中測定溶液在630nm下的吸光值（OD630），以實驗條件下每106個體腔細胞對應的吸光值（OD630）大小來表示呼吸爆發活力。

1.4.5 總超氧化物歧化酶（T－SOD）的測定 使用南京建成生物工程研究所生產的總超氧化物歧化酶（TSOD）測試盒，采用黃嘌呤氧化酶法進行測定。以每毫升反應液中SOD抑制率達50%時對應的SOD量為一個SOD活力單位（U/mL）。

1.4.6 一氧化氮合酶（NOS）活力測定 使用南京建成生物工程研究所生產的NOS測定試劑盒。通過NOS催化L－Arg與分子氧發生反應生成NO，進而與親和物質生成有色化合物的量來判斷NOS活力的大小，按照試劑盒的操作手冊要求進行。以每毫升CLS每分鐘生成1nmol NO為1個酶活力單位（U/mL）。

1.4.7 酸性磷酸酶（ACP）的測定 采用酸性磷酸酶檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行檢測，依據磷酸苯二鈉法，按照試劑盒的操作手冊要求進行。以每克CLS在37℃下與基質作用30min產生1mg酚的酶量為1個活力單位（U/g prot）。

1.4.8 體腔細胞蛋白含量的測定 采用Bradford[22]方法通過考馬斯亮藍進行測定，以小牛血清蛋白為標準蛋白，建立標準曲線。并用考馬斯亮藍進行顯色，反應在96孔酶標板中進行，在酶標儀中測定各反應體系中的OD595值。

1.4.9 刺參的累計死亡率 累計死亡率計算公式如下：

累積死亡率/% （Cumulative mortality）＝DT/D0×100%，

其中：D0和DT分別為攻毒過程中刺參初始頭數和累計死亡頭數。

1.5 統計分析

實驗數據（Mean±S.E.M）采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，當單因素方差分析（ANOVA）達顯著水平時（P＜0.05），進行Tukey多重比較。

2 結果

2.1 殼寡糖對刺參生長的影響

經過8周的養殖試驗，飼料中添加殼寡糖對仿刺參特定生長率有促進作用，與對照組相比，添加0.50%COS成活率提高了11.77%，但沒有顯著性差異（P＞0.05）（見表1）。

2.2 殼寡糖對刺參免疫反應的影響

2.2.1 吞噬活性 殼寡糖能提高刺參體腔細胞中的吞噬能力，吞噬能力在2.00%組達到最高，但與對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），各處理組之間也無顯著性差異（P＞0.05）（見表2）。

2.2.2 呼吸爆發 殼寡糖能顯著提高刺參體腔細胞的呼吸爆發能力（P＜0.05），當飼料中殼寡糖添加量為0.50%時，顯著高于殼寡糖添加量為2.00%處理組以及對照組（見表2）。

2.2.3 總超氧化物歧化酶 與對照組相比，飼料中添加殼寡糖對刺參體腔細胞的總超氧化物歧化酶活力沒有顯著影響（P＞0.05），但各處理組織之間，殼寡糖添加量為1.00%組總超氧化物歧化酶活力顯著高于0.25%處理組（P＜0.05）（見表2）。

2.2.4 酸性磷酸酶 殼寡糖對刺參體腔細胞的酸性磷酸酶活力有顯著性影響（P＜0.05）。且隨飼料中添加殼寡糖含量的升高呈現下降趨勢，各處理組酸性磷酸酶活力都顯著性低于對照組（P＜0.05），且最高劑量組，即殼寡糖添加量為2.00%組，酸性磷酸酶活力顯著低于其他各處理組（P＜0.05）（見表2）。

表1 飼料中添加殼寡糖對刺參生長性能的影響（平均數±標準誤，n＝4）1Table 1 Effects of dietary chitosan oligosaccharide on the growth of sea cucumber（A.japonicus）（Means±SE，n＝4）1

表2 飼料中添加殼寡糖糖對刺參免疫反應的影響（平均值±標準誤，n＝4）1Table 2 Effects of dietary chitosan oligosaccharide on immune response of sea cucumber（A.japonicus）（Means±SE，n＝4）1

2.2.5一氧化氮合酶 飼料中添加殼寡糖顯著提高了刺參體腔細胞中一氧化氮合酶的活力，一氧化氮合酶活力在0.50%處達到最高，與空白對照組、最低劑量組（0.25%）以及最高劑量組（2.00%）都存在顯著性差異（P＜0.05）（見表2）。

2.3 攻毒實驗

飼料中添加殼寡糖對刺參抵抗燦爛弧菌（V.splendidus）免疫保護力的測定結果見圖1。攻毒試驗結果表明，各組刺參14d的累積死亡率分別為52.78%、47.22%、36.11%、41.67%和55.56%，殼聚糖添加量為0.25%、0.50%和1.00%處理組的死亡率均低于對照組的死亡率，殼聚糖添加量為2.00%處理組的死亡率高于對照組，但并無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 投喂不同水平殼寡糖對刺參攻毒后死亡率的影響（平均數±標準誤，n＝4）Fig.1 Effects of dietary chitosan oligosaccharide on cumulative mortality of sea cucumber（A.japonicus）after infection with V.splendidus.（Means±SE，n＝4）

3 分析與討論

3.1 飼料中添加不同水平的殼寡糖對刺參生長的影響

殼寡糖作為飼料添加劑，已經在畜牧和水產類養殖中得到廣泛應用。同時殼寡糖對魚類等水產動物的生長促進作用，已在許多研究中得到證實。Refstie等[23]用含寡糖的餌料飼喂大西洋鮭，55d后與對照組相比，大西洋鮭的增重率和飼料系數都存在顯著性差異（P＜0.05）。孫立偉等[24]用添加不同濃度殼寡糖的飼料，飼喂吉富羅非魚幼魚，結果發現添加0.3%～0.5%殼寡糖可顯著提高吉富羅非魚幼魚生長性能以及飼料利用率。孫含亮等[25]在基礎飼料中添加不同水平的殼寡糖，飼養虹鱒，發現添加0.50%、0.75%和1.00%殼聚糖可以顯著提高虹鱒的特定生長率。本實驗研究中，在飼料中添加不同濃度的殼寡糖，對刺參生長都有一定促進作用，以0.50%殼寡糖最為明顯，與對照組相比刺參的特定生長率提高了11.77%。隨著殼寡糖濃度的增加，特定生長率呈現先增長后下降的趨勢，表明高劑量殼寡糖對刺參的特定生長率有抑制作用，但在劑量2.00%殼寡糖處作用不顯著。與其他的蝦類和魚類相比，刺參的生長速率較慢，因此在56d的養殖周期內，表現的促生長作用不顯著[26]。

3.2 飼料中添加不同水平的殼寡糖對刺參免疫反應的作用

殼寡糖作為一種寡糖類免疫增強劑，其免疫促進作用已經在許多研究中得以證實。Suzuki等[27]研究發現COS能增強T細胞表面IL－2受體的表達，加速T細胞的成熟以及分化成熟為效應T細胞。Wu和Tsai[28]研究發現COS能顯著增加小鼠IgG和IgM的含量。徐后國等[29]在飼料中添加了0.3%和0.6%的殼寡糖，顯著提高了大黃魚幼魚血清溶菌酶活力大小。免疫酶活常被用做衡量刺參免疫活力高低的指標[30－32]。江小璐等[33]在基礎飼料中添加0.1%的褐藻寡糖，研究其對酚氧化酶（POD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）活性的影響，發現寡糖均能顯著提高POD、ACP、AKP和LZM的活性。趙彥翠等[26]研究表明，當殼聚糖的添加量為10g/kg時，刺參體腔細胞密度和吞噬活性得到顯著提高，對刺參體腔細胞呼吸爆發活力有提高的作用，并且顯著降低酸性磷酸酶的活力。在本實驗中，飼料中添加0.50%COS對刺參的免疫反應有一定的刺激作用，表現為顯著提高了刺參體腔細胞的呼吸爆發能力和NOS活力，同時COS顯著抑制了酸性磷酸酶的活性，與李振達等[34]的研究結果不一致。這可能與實驗物種、實驗條件以及殼寡糖的聚合度等有關。

3.3 飼料中添加不同水平的殼寡糖對刺參抗病力的影響

很多研究表明，寡糖具有抗生素作用，可作為抗生素替代物用于提高細菌性疾病的預防以及防御[35]。COS在體外的抑菌實驗表明，濃度為0.3%～0.5%的COS對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、防線球菌、八疊球菌以及枯草桿菌都有抑制作用[36]。No等[37]研究了不同分子量殼寡（聚）糖對豆腐制品中腐生菌的抑制作用，結果發現，不同分子量殼寡（聚）糖對豆腐制品中腐生菌中的一些芽孢桿菌產生了不同的抑制作用。此外，飼料中添加殼聚糖還可以顯著提高異育銀鯽[38]、暗紋東方鲀[39]和草魚[40]抵抗嗜水氣單胞菌的能力。關于其抑菌機理，有研究認為，有些寡糖與病原菌（如霍亂菌、大腸桿菌、沙門氏菌等）在腸壁上的受體具有類似結構，與病原菌可競爭性的結合，甚至把已結合的病原菌部分置換下來，保障腸黏膜細胞的完整性，達到防治疾病發生的作用。在本實驗研究中，添加殼寡糖降低了燦爛弧菌攻毒后刺參的死亡率，但與對照組相比并沒有顯著差異，這與趙彥翠[26]究結果一致。

4 結語

本文首次研究了殼寡糖對刺參生長、免疫反應和抗病力的影響。結果表明，飼料中添加殼寡糖對刺參的生長有一定程度的促進作用，能提高機體免疫反應，并在一定程度上增強刺參抗病力?？傮w上來說，飼料中添加殼寡糖對刺參生長和抗病力具有一定的影響作用，但殼寡糖在刺參養殖方面的實際應用仍需進一步研究。

[1]廖玉麟.中國動物志－棘皮動物門－海參綱[M].北京：科學出版社，1997：53－64.

[2]謝小軍，鄧利，張波.饑餓對魚類生理生態學影響的研究進展[J].水生生物學報，1998，22（2）：181－187.

[3]沈文英，張利紅，鄭永萍，等.饑餓對銀鯽血液組分和卵巢發育的影響[J].動物學研究，2003，24（6）：441－444.

[4]張春云，王印庚，榮小軍，等.國內外海參資源、養殖情況及存在問題[J].海洋水產研究，2004，25（3）：89－97.

[5]王印庚，方波，張春云，等.養殖刺參保苗期重大疾病“腐皮綜合征”病原及其感染源分析[J].中國水產科學，2006，13（4）：610－616.

[6]張春云，王印庚，榮小軍.養殖刺參腐皮綜合征病原菌的分離與鑒定[J].水產學報，2006，30（1）：118－123.

[7]Xing J，Leung M F，Chia F S.Quantitative analysis of phagcytosis by amoebocytes in a sea cucumberHolothurialeucospilota[J].Invert Biol，1998，117：67－74.

[8]Dolmatova L S，Eliseikina M G，Romashina V V.Antioxidant enzymatic activity of coelomocytes of the far East sea cucumberEupentactafraudatrix.[J].Evol Biochem Physiol，2004，40（2）：126－135.

[9]Haug T，Kjuul A K，Styrvold O B，et al.Antibacterial activity inStrongylocentrotusdroebachiensis（Echinoidea），Cucumariafrondosa（Holothuroidea），andAsteriasrubens（Asteroidea）[J].Invertebr Pathol，2002，81（2）：94－102.

[10]Boolootian R A，Giese A C.Clotting of echinoderm coelomic fluid[J].Exper Zool，1959，140：207－211.

[11]Lee H W，Park Y S，Jung J S，et al.Chitosan oligosaccharides，dp 2－8，have prebiotic effect on theBifidobacteriumbifidiumandLactobacillussp.[J].Anaerobe，2002，8（6）：319－324.

[12]Anraku M，Fujii T，Furutani N，et al.Antioxidant effects of a dietary supplement：Reduction of indices of oxidative stress in normal subjects by water－soluble chitosan[J].Food Chem Toxicol，2009，47（1）：104－109.

[13]Chen Y J，Kim I H，Cho J H，et al.Effects of chitooligosaccharide supplementation on growth performance，nutrient digestibility，blood characteristics and immune responses after lipopolysaccharide challenge in weanling pigs[J].Livestock Science，2009，124（1－3）：255－260.

[14]Kolman H，Siwicki A K，Kolman R.The effect of natural immunodulators applied is immersion on norr specific immune responses in Russian sturgeon（AcipensergueldenstadetiBrandt）[J].Arch Ryb Pol，1998，6（2）：391－410.

[15]Sun T，Yao Q，Zhou D，et al.Antioxidant activity of N－carboxymethyl chitosan oligosaccharides[J].Bioorg Med Chem Lett，2008，18（21）：5774－5776.

[16]Anderson D P，Siwicki A K.Duration of protection againstAeromonassalmonicidain brook trout immunostimulated with glucan or chitosan by injection or immersion[J].Pro Fish Cult，1994，56：259－261.

[17]Anderson D P，Siwicki A K.Duration of protection againstAeromonassalmonicidain brook trout immunostimulated with glucan or chitosan by injection or immersion[J].Pro Fish Cult，1994，56：259－261.

[18]Cao Q Z，Lin Z B.Antitumor and anti－angiogenic activity ofGanodermalucidumpolysaccharides peptide[J].Acta Pharmacol Sin，2004，25：833－838.

[19]王斌，趙文，范薇，等.復方中藥制劑對草魚免疫細胞功能及抗病力影響的初步研究[J].大連水產學院學報，2007，22（3）：203－206.

[20]Zhang Q，Tan B P，Mai K S，et al.Dietary administration ofBacillus（B.licheniformisandB.subtilis）and isomaltooligosaccharide influences the intestinal microflora，immunological parameters and resistance againstVibrioalginolyticusin shrimp，Penaeusjaponicus（Decapoda：Penaeidae）[J].Aquaculture Research，2011，42（7）：943－952.

[21]Song H L，Hsieh Y T.Immunostimulation of tiger shrimp（Penaeusmonodon）hemocytes for generation of microbicidal substances：analysis of reactive oxygen species[J].Dev Comp Immunol，1994，18（3）：201－209.

[22]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72：248－25.

[23]Refstie Stale，Storebakken Trond，Roem A J.Feed consumption and conversion in Atlantic salmon （Salmosalar）fed diets with fish meal，extracted soybean meal or soybean meal with reduced content of oligosaccharides，trypsin inhibitors，lectins and soya antigens[J].Aquaculture，1998，162（3）：301－312.

[24]孫立威，文華，蔣明，等.殼寡糖對吉富羅非魚幼魚生長性能、非特異性免疫及血液學指標的影響[J].廣東海洋大學學報，2011，31（3）：43－49.

[25]孫含亮，孫敏敏，王紅衛，等.殼寡糖對虹鱒生長性能、血清生化指標及非特異性酶活的影響[J].動物營養學報，2012，24（3）：479－486.

[26]趙彥翠.刺參（ApostichopusjaponicusSelenka）多糖類免疫增強劑及微生態制劑的研究應用[D].青島：中國海洋大學，2010.

[27]Suzuki K，Okawa Y，Hashimoto K，et al.Protecting effect of chitin and chitosan on experimentally induced murine and candidasis[J].Microbiol Immunol.1984，28（8）：903－912.

[28]Wu G J，Tsai G J.Cellulase degradation of shrimp chitosan for the preparation of a water－soluble hydrolysate with immunoactivity[J].Fisheries Sci，2004，70：1113－1120.

[29]徐厚國，艾慶輝，麥康森，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖對大黃魚幼魚血清免疫指標的影響[J].中國海洋大學學報：自然科學版，2011，41（7/8）：42－47.

[30]孟繁伊，麥康森，馬洪明，等.棘皮動物免疫學研究進展[J].生物化學與生物物理進展，2009，36（7）：803－809.

[31]周慧慧.刺參（ApostichopusjaponicusSelenka）腸道益生菌的應用研究[D].青島：中國海洋大學，2010.

[32]Powell A，Rowley A F.The effect of dietary chitin supplementation on the survival and immune reactivity of the shore crab，Carcinusmaenas[J].Comparative Biochemistry and Physiology，2007，147（A）：122－128.

[33]江小璐，杜以帥，王鵬，等.褐藻寡糖對刺參體腔液和體壁免疫相關酶活性變化的影響[J].中國海洋大學學報：自然科學版，2009，6：1188－1192.

[34]李振達，陳小娥，廖智，等.殼寡糖對凡納濱對蝦生長和免疫力的影響[J].南方水產科學，2011，（4）：36－41.

[35]咼于明.動物免疫營養[M].北京：科學出版社，2011：138－149.

[36]嚴欽，沈月新，王慥，等.殼寡糖的制備及其抑菌性能研究[J].食品研究與開發，2003，24（2）：28－36.

[37]No H K，Park N Y，Lee S H，et al.Antibacterial activities of chitosans and chitosanoligomers with different molecular weights on spoilage bacteria isolated from tofu[J].J Food Sci，2002，67（4）：1511－1514.

[38]陳云波，華雪銘，周洪琪，等.殼聚糖對異育銀鯽生長及抗菌能力的影響[J].上海水產大學學報，2006，15（2）：243－246.

[39]Hua X M，Zhou H Q，Zhang D Q，et al.Effect of dietary chitosan and probiotics on disease resistance and immunity of obscure puffer（Fuguobscures）[J].Journal of fisheries of China，2007，31（4）：478－486.

[40]閆大偉，華雪銘，周洪琪.殼聚糖對草魚生長、抗病性能的影響[J].飼料工業，2007，28（12）：17－18.