單環刺螠纖溶酶Ⅲ基因克隆及原核表達＊

韓寶芹，杜 芳，畢慶慶，楊 艷，劉偉治，劉萬順

（中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島266003）

隨著人口老齡化加速、生活水平提高和壓力增大，血栓類疾病呈逐步上升趨勢。血栓疾病是一種血管內腔狹窄、循環系統閉塞引發的常見血管性疾病。靜脈血栓主要引發肺栓塞，而動脈血栓會導致心肌梗塞、中風、急性冠狀動脈綜合癥和外周動脈性疾病。據中國疾病預防控制中心（CDC）慢性病中心的統計資料顯示，心腦血管病是目前我國發病率、致殘率和死亡率最高的疾病[1]。因此，市場對溶栓劑需求將逐步增加，迫切需要療效好、半衰期長且安全性高的溶栓藥物。

目前具有代表性的纖溶酶如納豆激酶和蚓激酶都已進入臨床應用[2－3]，并且通過基因工程的手段得到了有活性的纖溶酶[4－5]。但海洋來源的纖溶酶基因克隆表達的工作還鮮有報道。本實驗室經過多年研究，從海洋無脊椎動物單環刺螠中分離純化得到1組新型纖溶酶，命名為單環刺螠纖溶酶（UFE），該酶包括4個分子量組分，按照分子量由大到小，分別是UFEⅠ、UFEⅡ、UFEⅢ、UFEⅣ。經研究4個UFE均具有顯著的抗凝、纖溶活性和較好的生物安全性，具有較大的開發價值[6－9]。但從生物體內直接分離提取存在耗時長，成本高，產率低等問題。為解決上述問題，本實驗室已完成UFEⅢ的基因克隆及構建了真核表達載體，本研究將進一步完成UFEⅢ的克隆和生物信息學分析，在此基礎上重組原核表達載體，以實現原核表達，為進一步獲得重組活性蛋白奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

單環刺螠（Urechisunicinctus）購自青島市南山市場；UFEⅢ是本實驗室制備；質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自博邁德公司；Trizol購自美國Invitrogen；PMD18－T、ExTaq聚合酶、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、5′－Full RACE Kit，TaKaRa；pET32a、pET28a及Rosetta2（DE3）為中國水產科學研究院黃海水產研究所饋贈；丙烯酰胺、N，N′－甲叉雙丙烯酰胺等分析純購自華晟科技有限公司；小鼠抗His標簽單克隆抗體、羊抗小鼠IgG－HRP、DAB顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質測序 UFEⅢ由上海基康生物技術有限公司測序，N端序列為IIGGSNAAITSY。

1.2.2 單環刺螠總RNA的提取及cDNA第一鏈合成

Trizol法提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠檢測后，根據PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行并用設計合成的3′RACE Adoptor 5′－TACCGTCGTTCCACTAGTGATTTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTT－3′代替 Oligo dT Primer作為反轉錄引物，得到cDNA第一條鏈。

1.2.3 簡并PCR 根據已測得的蛋白N端序列設計兩條正向簡并引物分別為211：5′－GCNG CNATHACNTCNTAC－3′，212：5′－GCNGCNATHACNAGYTAC－3′，根據3′RACE Adoptor設計反向引物 OP：5′－TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT－3′。利 用 Touchdwn PCR擴增得到目的片段，經瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收得到的片段與PMD18－T連接后，轉化感受態E.ColiDH5α，涂布含有Amp抗性的LB固體培養基，37℃培養后，利用菌落PCR篩選到陽性菌株進行測序。

1.2.4 5′RACE PCR 根據5′－Full RACE Kit說明書進行5′－Full RACE PCR。所用引物根據簡并 PCR的測序結果設計，GSP1：5′－TACTCCCACAAGCAGATTGCCACAG－3′， GSP2： 5′－TGATTAATGCGGGATGCCACACTG－3′，擴增體系及參數見說明書，其中退火溫度為55℃，擴增得到的PCR產物，經回收后，進行測序。

1.2.5 UFEⅢ基因全長擴增 根據5′RACE PCR的測序結果，設計正向引物ust：5′－GGAAACCACAATGAAGACCATCCT－3′，根據簡并PCR的測序結果設計反向引物OP：5′－TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT－3′。擴增體系為：cDNA 模板 1μL，ExTaq0.25μL，10×ExTaqbuffer 5μL，dNTP 4μL，ust（10 μmol/L）2μL，OP（10μmol/L）2μL，ddH2O 35.75 μL，總體積50μL，PCR擴增退火溫度為54℃。

1.2.6 生物信息學分析 使用 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BlASTx程序對 UFEⅢ的cDNA序列進行比對分析，使用BioEdit軟件將cDNA序列翻譯為氨基酸序列，對推導出的蛋白序列利用NCBI保守區域數據庫CDD（Conserved Domain Database）及PROSITE軟件進行蛋白結構域、活性位點及二硫鍵的預測，SingalP程序分析信號肽，利用SWISS MODEL法對該蛋白進行構象預測。

1.2.7 pET32a－UFE/pET28a－UFE 重組載體的構建根據UFEⅢ克隆片段及載體pET32a/pET28a上酶切位點的特性，設計擴增引物 E5Sen：5′－GGATCCATCATTGGAGGCAGCAATGC－3′，E5Anti： 5′－CTCGAGGTTGTTGTTGATCCAGG－3′，內設BamH1和Xho1酶切位點，以PMD18－T－UFE為模板，進行PCR。PCR擴增產物與PMD18－T連接，測序后，測序正確的PMD18－T－UFEⅢ與pET32a/pET28a分別進行BamH1和Xho1雙酶切，回收酶切后的片段，用T4連接酶16℃連接過夜。

1.2.8 重組載體轉化Rosetta2（DE3） 按常規方法制備Rosetta2（DE3）感受態細胞[10]，4℃放置過夜后，將重組載體pET32a－UFE/pET28a－UFE分別轉化入Rosetta2（DE3）中，取100μL轉化后的菌液涂布在含有Amp＋和Cam＋的LB固體平板上37℃培養12～16h。

1.2.9 UFE在Rosetta2（DE3）中的誘導表達 挑取1.2.8中的菌落，接種入5mL LB液體培養基中，37℃過夜活化。次日，將活化后的菌液按1∶100轉接入100mL的LB液體培養基中，繼續37℃培養至OD600＝0.6后，分別加入終濃度為0.2、1mmol/L的IPTG 分別進行過夜誘導表達。次日，4℃，6 000r/min離心30min收集菌體，用20mmol/L的 Tris－HCl（pH＝8），200mmol/L NaCl的破碎緩沖液洗滌后懸浮，超聲波破碎（工作5s，間歇10s）。離心分別收集上清和沉淀，進行SDS－PAGE檢測。

破碎得到的蛋白上清液（pET32a－UFE）上樣于預先經破碎緩沖液平衡的 Ni2＋－NTA 柱，用20mmol/L咪唑洗脫雜蛋白后，用咪唑梯度 50、100、200、400 mmol/L洗脫目的蛋白，收集洗脫液進行SDS－PAGE和Western Bloting法檢測，WB方法參考博士德 W－B試劑盒說明書，其中一抗為小鼠抗His標簽單克隆抗體，按1∶1 500稀釋，二抗為羊抗小鼠IgG－HRP，按1∶400稀釋。其余的留樣用Bradford法檢測蛋白含量后，用纖維蛋白平板法測酶活[11]。破碎菌液（pET28a－UFE）得到的包涵體，溶于變性緩沖液中（6mol/L鹽酸胍，200mmol/L NaCl，20mmol/L Tris－HCl（pH＝8），15mmol/L Dithiothreitol），至蛋白終濃度0.1～0.2 mg/mL，4℃溶解過夜。4℃，12 000r/min，離心15 min，收集上清后，將蛋白溶解液裝入透析袋中，放入500mL鹽酸胍梯度復性緩沖液中，分別透析8～12h，復性緩沖液為20mmol/L Tris－HCl（pH＝8），100 mmol/L NaCl，1mol/L的 Arg，分別加入3、2、1mol/L的鹽酸胍，最后透析至20mmol/L Tris－HCl（pH＝8），100mmol/L NaCl中。之后，4℃，12 000r/min，離心15min，收集上清，進行SDS－PAGE檢測，纖維蛋白平板測酶活性。

2 實驗結果

2.1 單環刺螠總RNA的提取

新鮮蟲體提取總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，可見到較清晰的28、18、5s條帶，OD260∶OD280的值為1.781。

2.2 UFEⅢ全長擴增

2.2.1 簡并PCR及5′RACE PCR 以總 RNA為模板，3′RACE Adoptor為反轉錄引物，反轉錄出cDNA第一條鏈，以此為模板，以212和OP分別為正反向引物，擴增出約750bp的產物，根據得到的簡并PCR產物設計引物，利用5′RACE試劑盒擴增得到約300bp的產物，該產物的測序結果與簡并PCR的測序結果約有208個堿基的重疊。

2.2.2 UFEⅢ全長擴增 根據簡并PCR及5′RACE PCR的測序結果設計正反向引物擴增UFEⅢ全長，得到大小約900bp的PCR產物。將擴增得到的PCR產物進行測序，得到UFEⅢ全長cDNA序列（見圖1）。全長cDNA為863bp，其中開放閱讀框為786bp（Gen－Bank accession number KC695751）。

2.2.3 UFEⅢ的生物信息學分析 利用BlASTx軟件對UFEⅢ進行同源性比對（見圖2），結果顯示，該酶與本實驗之前克隆到的UFEⅡ[12]在蛋白序列上有45%的相似性，并且經過實驗驗證UFEⅡ和UFEⅢ都有降解纖維蛋白的功能[11]，初步判斷UFEⅡ和UFEⅢ為存在于單環刺螠體內具有纖溶活性的同工酶。其他與之相似度較高的蛋白為沙躅胰凝乳蛋白酶，蚓激酶，蚯蚓纖溶酶等。

圖1 UFEⅢ基因及其編碼的氨基酸序列帶有下劃線依次為：起始密碼子，蛋白質N端序列，終止密碼子Fig.1 Nucleotide squence and deduced amino acid sequence of the UFEⅢ.Underline：start codon，protein N terminal squence，stop codon

利用NCBI的保守數據庫CDD（Conserved Domain Database）分析UFEⅢ的保守性。結果顯示該酶屬于胰蛋白酶樣絲氨酸酶家族，通常為無活性的前體形式，經過限制性蛋白酶水解產生有活性的酶，酶切位置第33～34氨基酸處，預測的剪切位置與蛋白質N端序列位置吻合。UFEⅢ中存在12個半胱氨酸，其中有6個參與形成了3對二硫鍵（Cys61－Cys77，Cys154－Cys222，Cys185－Cys203），這些二硫鍵的存在使其所在的超二級結構更加穩固。此外有3個絲氨酸蛋白酶活性位點，3個特異性底物結合位點。進一步使用PROSITE軟件對氨基酸序列進行分析，該蛋白質含有1個trypsin domain位于第34～261位置處，與蛋白質N端位置一致，其中第76位處的（H），第122位處的（D），第216位處的（S）為其活性位點。

圖2 UFEⅢ的蛋白相似性比對Fig.2 Similarity comparison of amino acid between UFEⅢ with other protein in database

根據 SignalP（http：//cbs.dtu.dk/services/SignalP）信號肽分析軟件對UFEⅢ氨基酸序列的分析，該蛋白在第16和17個氨基酸處被信號肽酶切的可能性較大，因此該酶的信號肽應該是包含1～16個氨基酸。UFEⅢ的成熟肽共有228個氨基酸，相對分子質量為23 192.90Da，等電點約為8.58。

使用SWISS MODEL法對該蛋白進行構象預測發現在蛋白的三級結構上與來自于Eiseniafetida的纖溶酶有40%的相似性，所以以Eiseniafetida的纖溶酶的三維晶體結構（PDB：1m9uA）為模板構建出的UFE三級結構（見圖3），該蛋白的核心結構接近全β結構，這些β折疊往往含較多的非極性殘基，埋在蛋白質內部形成疏水核心。

圖3 UFE三級結構預測Fig.3 The predicted 3Dstructure of UFE

2.3 UFE在原核中的表達

2.3.1 UFE表達載體的構建 以克隆到的UFE的基因全長為模板，PCR得到約680bp的產物，BamH1、Xho1雙酶切PCR產物及pET32a和pET28a，T4連接酶16℃連接過夜后，轉化感受態E.coliDH5α，酶切檢驗后測序選取正確的陽性克隆提取重組質粒進行轉化。

2.3.2 UFE的重組表達 將重組載體pET32a－UFE和空載體pET32a分別轉入 Rosetta2（DE3）中，在0.2 mmol/L的IPTG誘導下，22℃過夜誘導后，超聲破碎，收集上清和包涵體。上清過Ni柱，純化目的蛋白。從圖中看到在44kD附近位置處有特異性的條帶（目的蛋白為23kD，融合Trx標簽后為43kD），而空載對照無此蛋白，雖然目的蛋白大部分以包涵體的形式表達，但上清中也得到了少量表達，并且也純化出了部分蛋白（見圖4），經 WB檢測此蛋白為目的蛋白（見圖5），但在纖維平板上未檢測到明顯的纖溶活性（陽性對照為從單環刺螠體內提取到的天然UFEⅢ，陰性對照為空載誘導表達后的上清）。分別將重組載體pET28a－UFE和空載體pET28a轉入Rosetta2（DE3）宿主菌中，在1mmol/L的IPTG誘導下，30℃過夜誘導，超聲破碎，SDS－PAGE檢測（見圖6），電泳顯示，目的蛋白以包涵體的形式得到了表達，收集包涵體后，進一步進行蛋白復性實驗，復性結束后，離心取上清進行SDSPAGE和纖維平板活性檢測，從圖中看到，雖然復性后的蛋白以可溶的形式存在，但仍未檢測到明顯的纖溶活性（見圖7）。

圖4 UFE上清蛋白表達Fig.4 Supernatant recombinant protein expresion of UFE

圖5 Trx－UFE的免疫印跡Fig.5 Western Blotting of Trx－UFE

3 討論

圖6 UFE包涵體表達Fig.6 Inclusion body expresion of UFE

圖7 UFEⅢ的纖溶活性測定Fig.7 Fibrinolytic activity of product UFEⅢ on fibrin plate

本研究首次克隆得到了UFEⅢ的基因序列，對其進行了生物信息學分析，增加了對該蛋白的了解，為其功能研究做了理論基礎，對翻譯后蛋白活性調節有一定的理論意義。與之前本實驗室克隆到的UFEⅡ進行了基因及氨基酸序列的比對，發現其在氨基酸序列上有45%的相似性，為今后纖溶酶的基因改造以及探究其體內多種纖溶酶的作用機理和遺傳特征奠定基礎。

本研究綜合考慮蛋白表達后的用途及安全性等方面，首選了大腸桿菌進行表達，構建了硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）與 UFE 的融合蛋白 Trx－UFE在Rosetta2（DE3）中表達，得到了一定量可溶性的目的蛋白，后期也嘗試過把可溶部分的標簽切除，卻仍未獲得有活性的纖溶酶，究其原因，是由于大腸桿菌胞內缺乏幫助該真核蛋白正確折疊的分子伴侶及二硫鍵形成的氧化還原酶，而且該基因來自于海洋生物，基因組序列存在一定的特殊性。這個結果也表明了雖然融合蛋白可以幫助目的蛋白以可溶的形式存在，但對某些蛋白的正確折疊所起的作用不明顯。

由于在大腸桿菌胞內未得到有活性的纖溶酶，所以又構建了不含融合標簽的重組載體pET28a－UFE，通過誘導表達，包涵體的復性等嘗試，最后也得到了可溶的目的蛋白，但仍未檢測到活性，分析原因可能是該蛋白在復性的過程中形成了穩定的中間體但未形成其正確的蛋白構象。由于蛋白質體外復性的過程較復雜，雖然目前已經報道了許多復性的方法，但因蛋白質的性質各異，尚沒有一種對所有蛋白質都適用的方法[13]。 根據許 多研究者對蛋白復性機制的研究[14－15]，認為肽鏈折疊成活性蛋白并不是一步完成的，在蛋白的再折疊過程中由于缺乏輔助折疊的蛋白和酶，同時還會受到聚集反應的競爭，在折疊過程中會存在某些能壘，阻礙蛋白形成最穩定的分子構象，導致蛋白處于可能的穩定狀態。

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