siRNA沉默HIF-lα基因對前列腺癌PC3細胞生長增殖及凋亡的影響*

付振宇張 鴿黃玉華嚴春寅

俞 江3孫利國1陳永昌1繆 瑜1**張 杰1

1.揚州大學第五臨床學院暨常熟市第二人民醫院泌尿外科（常熟 215500）;

2. 蘇州大學附屬第一醫院泌尿外科; 3.上海交通大學醫學院附屬蘇州九龍醫院泌尿外科

siRNA沉默HIF-lα基因對前列腺癌PC3細胞生長增殖及凋亡的影響*

付振宇1張 鴿1黃玉華2**嚴春寅2

俞 江3孫利國1陳永昌1繆 瑜1**張 杰1

1.揚州大學第五臨床學院暨常熟市第二人民醫院泌尿外科（常熟 215500）;

2. 蘇州大學附屬第一醫院泌尿外科; 3.上海交通大學醫學院附屬蘇州九龍醫院泌尿外科

目的探討沉默缺氧誘導因子-lα（hypoxia inducible factor-lα，HIF-lα）基因對前列腺癌PC3細胞生長增殖及細胞凋亡的影響。方法實驗分為PC3組（空白對照組）、PC3+NC siRNA組（陰性對照組）和PC3+HIF-lαsiRNA組（干擾組）。使用經過篩選證實有效的HIF-lα-siRNA序列和陰性對照NC-siRNA序列，經脂質體Lipofectamine 2000轉染PC3細胞。采用CCK-8法檢測轉染后96h內各組細胞的生長增殖情況，流式細胞儀檢測轉染后48h各組細胞的凋亡率。結果PC3+HIF-lαsiRNA組腫瘤抑制率高于PC3+NC siRNA組，尤以轉染后第48h表現得較為明顯；在第48h，PC3+HIF-lαsiRNA組細胞存活率明顯低于PC3組和PC3+NCsiRNA組（P＜0.01）。轉染后第48h，干擾組細胞凋亡率為（11.2±1.13）%，PC3組和PC3+NC siRNA組細胞凋亡率分別為（2.4±0.26）%和（2.5± 0.36）%，干擾組細胞凋亡率顯著高于兩對照組（P＜0.01）。結論 沉默HIF-lα基因能抑制前列腺癌PC3細胞的生長，誘導癌細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。

微RNAs; 前列腺腫瘤; 細胞系, 腫瘤; 缺氧誘導因子1, α亞基; 細胞增殖; 細胞凋亡

實體腫瘤增大到約1～2mm3時，內部會出現乏氧的微環境，此時惡性腫瘤細胞將產生一系列生物學行為的變化來適應低氧狀態。缺氧誘導因子-lα（hypoxia inducible factor-lα，HIF-lα）通過調節腫瘤細胞能量代謝、生長凋亡、血管生成、侵襲轉移等使腫瘤細胞適應缺氧微環境，促使腫瘤進展。HIF-lα在這些過程中起著中心介導作用[1]，降低HIF-lα的表達可能有抗腫瘤的作用。本研究通過小干擾RNA（siRNA）沉默前列腺癌PC3細胞HIF-lα基因，檢測細胞增長、凋亡的變化，觀察沉默HIF-lα基因對PC3細胞生物學行為的影響。

材料與方法

一、材料

前列腺癌PC3細胞購自中科院上海細胞生物研究所；脂質體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自日本DOJINDO公司；凋亡試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所。根據HIF-1α（GenBank Accession Number：NM_001530）基因信息，使用siRNA序列設計軟件，選擇了針對目的基因的siRNA序列及陰性對照序列NC，并設計其互補的模板單鏈，額外設計了TT或dTdT懸掛末端，以增加siRNA的穩定性。人HIF-1α序列特異性的siRNA與人EST數據庫做BLAST序列比對，確認與其他基因無結合位點；陰性對照序列與哺乳動物無同源性，siRNA委托上海吉瑪生物科技有限公司合成。HIF-lαsiRNA、陰性對照NC-siRNA及熒光標記的FAM-NC-siRNA的設計、篩選、驗證等均在蘇州大學免疫研究所進行。篩選出的有效HIF-lα-siRNA靶向HIF-lα mRNA的位點為792-812，正義鏈為5’-GUGAUGAA AGAAUUACCGAAUTT-3’， 前列腺癌PC3細胞被HIF-lα-siRNA靶向干擾后48h在mRNA水平的抑制率為71%，在蛋白水平的抑制率為70.27%。NC- siRNA片段正義鏈序列為5’- UUCUCCGAACGUGUCACG UdTdT-3’。

二、方法

（一）實驗分組及細胞培養

實驗分PC3組（空白對照組）、PC3+NCsiRNA組（陰性對照組）及PC3+HIF-lαsiRNA組（干擾組）。PC3細胞常規培養于10%胎牛血清（FBS）的MEM培養液中，37℃、5%CO2的孵箱內培養。每2～3d 1:2傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗。轉染時將PC3細胞置入無血清的MEM中培養，根據Lipofectamine 2000操作說明按分組要求轉染或不轉染siRNA（濃度為40nmol/L）。轉染6h后將培養基換成含10%FBS的MEM繼續溫育。

（二）CCK-8法檢測各組細胞的生長增殖

轉染或不轉染后將各組細胞調成終濃度為1×10個/mL的單細胞懸液接種于96孔板，每組設6個時間點，分別為：0、12 、24、48、72、96h，每小組設個復孔；細胞培養至每個時間點取出相應的96孔板，加入CCK-8液，繼續培養4h后在酶聯免疫檢測儀上測定細胞450nm波長處的吸光度值（OD值）。

（三）Annexin V-FITC/PI法檢測各組細胞的凋亡率

每組細胞設3復孔，轉染或不轉染后將各組細胞繼續培養48h，收集細胞離心后用PBS洗滌兩次，棄上清，加入Binding Buffer懸浮細胞，然后加入Annexin V-FITC混勻，再加入PI，室溫避光反應15min，在1h內上FCM檢測細胞凋亡率。

（四）統計學處理

采用SAS8.1軟件包對實驗結果進行統計分析；計量資料以±s 表示，采用單因素方差分析SNK法，P＜0.05差異有統計學意義。

結 果

一、3組PC3細胞的生長增殖情況

根據檢測的OD值計算出生存率，其計算公式為：某時間點生存率（存活率）=該時間點實驗組平均OD值/該組0h的平均OD值，并根據生存率繪制各組PC3細胞存活曲線圖（圖1）。結果顯示：在第12h，各組PC3細胞存活數無明顯差異，細胞增殖均較慢；至第24 h，3組細胞存活數均緩慢升高，但干擾組PC3細胞存活數稍低于空白對照組和陰性對照組（F=6.47，P=0.03）。第48 h，兩對照組PC3細胞增殖顯著加速，而干擾組細胞增殖仍維持在較低水平；干擾組與兩對照組比較，存活數差異顯著（F=53.77，P＜0.01），而兩對照組細胞存活數無明顯差異（P＞0.05）。第72h和第96h，兩對照組細胞增殖速度有所減慢，干擾組細胞增殖速度有所加速，但干擾組存活數仍明顯低于兩對照組（F72h=31.29，P72h＜0.01；F96h=14.81，P96h＜0.01）。總體來說，沉默HIF-lα基因后，PC3細胞的存活率明顯降低，以第48h下降最明顯。

圖1 3組PC3細胞的生存率曲線

二、3組PC3細胞的凋亡情況

干擾組細胞的平均凋亡率為（11.2±1.13）%，PC3組和PC3+NC siRNA組細胞平均凋亡率分別為（2.4±0.26）%和（2.5±0.36）%，干擾組較兩對照組細胞凋亡率顯著升高（F=150.14 ，P＜0.01）,而兩對照組之間無明顯差別（P＞0.05）（見圖2）。

圖2 3組PC3細胞的凋亡率比較

討 論

有報道[2]，HIF-lα在包括肺癌、前列腺癌、胃腸道惡性腫瘤、腎癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中呈特異性的高表達。HIF-lα表達上調利于腫瘤細胞適應低氧微環境，并加速腫瘤惡性進程。我們前期用免疫組化方法亦證實[3-5]：HIF-lα蛋白在前列腺癌組織中高表達；HIF-lα的表達與前列腺癌的惡性程度呈正相關，與前列腺癌的形成及癌細胞的增殖密切相關；HIF-lα的表達與前列腺癌的臨床分期相關，它們參與了前列腺癌的惡性進程。因此，降低HIF-lα的表達可能有抑制腫瘤的作用。RNA干擾可特異性的使特定基因的mRNA發生降解或蛋白質翻譯抑制，從而誘發基因沉默現象[6]，被認為是高效特異的降低基因表達的方法之一。本實驗用經證實有效的人工化學合成的HIF-lα-siRNA轉染PC3細胞以沉默HIF-lα基因的表達，觀察其對PC3細胞生長增殖、凋亡表達的影響。

我們采用CCK-8法測定轉染后96h內各組PC3細胞的存活情況，實驗結果顯示：干擾組細胞生長增殖明顯慢于兩對照組，且這種差異在轉染后第48h顯得尤其明顯，而兩對照組之間無差異。通常轉染后24h內就能引起細胞內HIF-lα蛋白水平的下降，而干擾組PC3細胞在24h內這種生長抑制變化不明顯，可能是轉染后所引起的HIF-lα的mRNA和蛋白及生物學行為的改變存在起作用的時間延遲現象；轉染后第48h這種蛋白水平的下降更明顯，可能是引起抑制細胞生長及促進細胞凋亡等相關的重要蛋白表達發生改變，最終表現為細胞生長變慢。而轉染72h后，由于siRNA從轉染的細胞中開始逐漸脫落，引起HIF-lα介導的細胞生長抑制作用逐漸減弱，轉染細胞重新生長加速。因此我們認為：siRNA沉默HIF-lα可以抑制前列腺癌PC3細胞的生長增殖，具有抗腫瘤作用，這種作用在轉染后48h左右達到高峰。前列腺癌細胞的生長受多種生長因子[7,8]包括胰島素樣生長因子-（IGF-1）、轉化生長因子-α（TGF-α）、成纖維細胞生長因子（FGF）等調控，而HIF-lα的高表達可刺激IGF-1、TGF-α、FGF等的分泌，促使前列腺癌細胞生長增殖。沉默HIF-lα基因有可能引起IGF-1、TGF-α、FGF等生長因子表達下調，導致腫瘤生長增殖減慢。這可能是我們在實驗中觀察到的沉默HIF-lα基因后前列腺癌細胞的存活與增殖受到抑制的機制之一，但具體是通過哪些因子的作用，目前還不太明確，尚需進一步的深入研究以證實。

凋亡是細胞對環境的生理性、病理性刺激信號、環境條件的變化或緩和性損傷產生的應答有序變化的死亡過程。HIF-lα對細胞凋亡中的調控作用存在著兩個不同方面：一方面，HIF-lα能增加無氧代謝、糖酵解和一些凋亡前基因的表達，起抗凋亡作用，同時HIF-lα還能與人端粒末端逆轉錄酶（hTERT）基因相互作用，誘導活化hTERT，從而增加端粒酶的活性，延長端粒，起抗凋亡作用[9]；另一方面，HIF-lα能通過阻斷P53降解與穩定P53、上調Bcl-2家族促凋亡基因BNIP3等途徑起到促凋亡作用[10]。因此，目前認為HIF-lα對凋亡的雙向調控作用會因細胞類型和環境條件而異。在本研究中，我們觀察到： 干擾組PC3細胞在轉染HIF-lα-siRNA后48h，凋亡率高于其他兩對照組，但是增加的幅度不大，提示沉默HIF-lα基因在一定程度上能誘導PC3細胞凋亡，發揮抗腫瘤效應。這與Zhang等[11]報道的結果類似：利用RNA干擾下調口腔鱗狀細胞癌HIF-lα的表達水平，能顯著抑制細胞生長，促進細胞凋亡。沉默HIF-lα的促凋亡作用機制可能是：HIF-lα可增加無氧代謝、糖酵解和一些凋亡前基因的表達，起抗凋亡作用，同時HIF-lα還能通過與hTERT基因的相互作用來誘導活化hTERT，從而增加端粒酶的活性，延長端粒，起抗凋亡作用[12]，而沉默PC3細胞的HIF-lα基因后，有可能使這種抗凋亡作用減弱，從而導致腫瘤細胞凋亡。

1 Le QT, Giaccia AJ. HIF-alpha, a gender independent transcription factor.Clin Cancer Res2003; 9(7): 2391-2393

2 Hung JJ, Yang MH, Hsu HS,et al. Prognostic signif cance of hypoxia-inducible factor-1alpha, TWIST1 and Snail expression in resectable non-small cell lung cancer.Thorax2009; 64(12): 1082-1089

3 黃玉華, 嚴春寅, 溫端改, 等. 缺氧誘導因子-1α和血管內皮細胞生長因子在前列腺癌組織中的表達. 臨床泌尿外科雜志 2004; 19(1): 36-38

4 嚴春寅, 黃玉華, 溫端改, 等. 缺氧誘導因子-1α與前列腺癌生物學行為的關系. 江蘇醫藥 2005; 31(7): 489-49 5 Huang Y, Yu J, Yan C,et al. Effect of small interfering RNA targeting hypoxia-inducible factor-1α on radiosensitivity of PC3 cell line.Urology2012; 79(3) 744. e17-e24

6 Kim DH, Rossi JJ. Strategies for silencing human disease using RNA interference.Nat Rev Genet2007; 8(3): 173-184

7 Yewalkar N, Deore V, Padgaonkar A,et al.Development of novel inhibitors targeting HIF-lα towards anticancer drug discovery.Bioorg Med Chem Lett2010; 20(22): 6426-6429

8 張華鋒, 孔垂澤. SATBl蛋白在人前列腺癌組織中的表達及臨床意義. 中國男科學雜志 2012; 26(5): 11-13,18

9 Erler JT, Cawthorne CJ, Williams KJ,et al.Hypoxiamediated down-regulation of Bid and Bax in tumors occur via hypoxia-inducible factor 1-dependent and independen mechanisms and contributes to drug resistance.Mol Cell Biol2004; 24(7): 2875-2889

10 Suzuki H, Tomida A, Tsuruo T. Dephosphorylated hypoxia-inducible factor 1alpha as a mediator of p53-dependent apoptosis during hypoxia.Oncogene2001; 20(41): 5779-5788

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12 Zhang P, Chan SL, Fu W,et al. TERT suppresses apoptotis at a premitochondrial step by a mechanism requiring reverse transcriptase activity and 14-3-3 protein-binding ability.FASEB J2003; 17(6): 767-769

（2014-09-17收稿）

Effects of downregulation of HIF-lα on proliferation and apoptosis of human prostate cancer cells PC3*

Fu Zhenyu1, Zhang Ge1, Huang Yuhua2**, Yan Chunyin2,
Yu Jiang3, Sun Liguo1, Chen Yongchang1, Miao Yu1**, Zhang Jie11. Department of Urology, the No 2 People's Hospital of Changshu, Changshu 215500, China; 2. Department of Urology, the First Aff liated Hospital of Soochow University; 3. Department of Urology, Aff liated Suzhou Kowloon Hospital of Shanghai
Jiao Tong University Medical School

Huang Yuhua, E-mail: hyhjxnc@163.com; Miao Yu, E-mail: miaoyu1978@sina.cn

ObjectiveTo investigate the effects of hypoxia inducible factor-lα gene silencing with siRNA on the proliferation and apoptosis of human prostate cancer cells.MethodsPC3 cells were divided into three groups such as PC3 group, PC3+ NC siRNA group and PC3 + HIF-lα siRNA group. Cells in each group were transfected with HIF-lαsiRNA using Lipofectamine 2000. CCK-8 test was used to measure the proliferation of PC3 cells. Flow cytometer was used to measure cell apoptosis.ResultsSurvival rate of PC3+HIF-lα siRNA group was signif cantly lower than that of other two control groups at 24h, 48h, 72h and 96h after transfection (P<0.01). The interference effect reached its peak at 48h after transfection. The rates of cell apoptosis of PC3 + HIF-lα siRNA group, PC3 group, PC3+ NC siRNA group at 48h after transfection were (11.2±1.13)%,(2.4±0.26)% and (2.5±0.36)% respectively; The apoptosis rates of PC3 + HIF-lα siRNA group was higher than that of the others (P<0.01).ConclusionSilencing HIF-lα gene can effectively inhibit cell proliferation, and induce the apoptosis of PC3 cells.

microRNAs; prostatic neoplasms; cell line, tumor; hypoxia inducible factor 1, alpha subunit; cell proliferation; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.12.002

R 737.25

資助: 常熟市科技發展計劃（社會發展類）項目（CS201425）

**共同通訊作者: 黃玉華, E-mail: hyhjxnc@163.com; 繆瑜, E-mail: miaoyu1978@sina.cn