海洋枝頂孢霉BH0531代謝物對松材線蟲形態和酶活的影響

杜海霞，蒙春蕾，王勇勇，孟慶恒，2 *，孫建華，2

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

全球每年因植物寄生線蟲造成的損失達1 570億美元[1]，我國每年有超過5 000萬株松樹死于松材線蟲病，松材損失超過500萬m3，年均發生面積近6萬hm2，研究和開發高效的殺線蟲制劑迫在眉睫[2]。真菌資源作為生物防治線蟲的熱點研究領域[3]，已從700多種殺線活性菌株中分離獲得殺線活性物質230余種[4-5]。

枝頂孢霉屬（Acremonium）是已知的具有殺線蟲活性的種屬之一，該屬約有130余種，主要營腐生、植物寄生和自生，具有豐富的遺傳和生態多樣性[6-7]，特別是陸生性菌種有許多已被證實具有殺線蟲活性[8]，如頂孢霉（A.coenophialum）能夠降低短體線蟲（Pratylenchus scribneri）和矮化線蟲（Tylenchorhynchus acutus）蟲口密度[9]；枝頂孢霉（A.stricturn）能夠破壞甜菜胞囊線蟲（Heterodera schachtii）的卵[10]，抑制大豆胞囊線蟲（H.glycines）和南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）卵的孵化[11]。海洋來源的枝頂孢霉（Acremoniumsp.BH0531）也被證實具有明顯的殺線蟲作用，其代謝物具有分子質量小、水溶性好和耐熱的特性[12]。在此基礎上，從線蟲的相關酶學變化和表觀效應的角度對BH0531代謝物的殺線蟲效應進行了進一步研究，探討該菌對松材線蟲的可能作用機理。

乙酰膽堿酯酶（acetylcholin esterase，AChE)存在于大部分脊椎動物、昆蟲和線蟲神經元內，特別是膽堿能神經元、神經肌肉接頭處和肌肉組織中，能通過將類膽堿神經系統中神經遞質乙酰膽堿催化水解為乙酸和膽堿來終止神經遞質對突觸后膜的興奮作用，保證神經信號在生物體內正常傳遞，是生物神經傳導中的一種關鍵性酶，常被作為神經毒劑檢測的生化標志物，在毒理學研究上十分重要。而ATP酶通過水解ATP為生物體的一切生命活動提供能量，機體在缺氧及一些疾病狀態下，此酶活力會發生一系列改變。因此，本研究對松材線蟲體內與神經傳導密切相關的AChE和與運動能量代謝有關的ATP酶比活力進行測定，對BH0531代謝物的殺線機理進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海洋枝頂孢霉（Acremoniumsp.BH0531），菌種保藏號：CGMCC-5445、灰葡萄孢霉（Batrytis cinerea）：天津師范大學生命科學學院微生物實驗室；松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）：中國農科院植保所研究院。

乙酰膽堿酯酶AChE測定試劑盒、總ATP酶測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

實驗所用主要化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Leica DME光學顯微鏡：上海徠卡顯微系統有限公司；UV-2550紫外可見分光光度儀：美國Varian公司；XTB-A5538體視顯微鏡：桂林光學儀器廠；SPX-250B-Z生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HZ-2010K控溫搖瓶柜：上海欣蕊自動化設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 BH0531的培養

活化培養基：去皮馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，接種后于26 ℃恒溫箱內培養7 d。

發酵培養基：去皮馬鈴薯150 g煮汁，葡萄糖10 g，酵母膏1 g，海水600 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.3.2 灰葡萄孢霉菌的培養10 g大麥仁，8 mL去離子水，大試管浸泡3 h，滅菌，接入灰葡萄孢霉，21 ℃下避光培養7 d。

1.3.3 供試線蟲的培養與收集

在長滿了灰葡萄孢霉的大試管內接入大小為1 cm2的松材線蟲塊，25 ℃下避光培養12 d。用貝爾曼漏斗法收集松材線蟲，配制成15 000條/mL的懸液。

1.3.4 發酵液的制備

取新鮮培養的BH0531菌株斜面，加入無菌水洗脫孢子，制備成約1×106個/mL的孢子懸液，以2 mL接種量接入裝有100 mL液體發酵培養基的500 mL三角瓶中，26 ℃條件下，120 r/min振蕩培養4 d。將培養好的發酵液經真空抽濾后，4 ℃下離心（3 000 r/min、20 min），用孔徑為0.22 μm微孔濾膜過濾即為所需的發酵液部分。

1.3.5 粗酶液制備

將處理線蟲用無菌水離心洗滌3次（2 000 r/min，3 min/次）后，取蟲體置于預冷的滅菌勻漿器中，加入2 mL預冷生理鹽水，冰浴下勻漿15 min，4 ℃離心（3 000 r/min、20 min）取上清即為粗酶液。

1.3.6 生物活性檢測測定

鏡檢：以無菌水為對照，按照1 500 條/mL發酵液，分別處理松材線蟲2 h、4 h、8 h、16 h、32 h，每個處理設置3個重復。采用Leica光學顯微鏡，將不同處理時間段的線蟲取樣觀察拍照并攝像，每個時間段重復取樣3次，記錄視野范圍內線蟲的振幅和扭動次數并計算頻率。

酶比活力測定：采用南京建成生物工程研究所生產的乙酰膽堿酯酶AChE測定試劑盒與總ATP酶測定試劑盒，結合用UV-2550紫外可見分光光度儀，分別測定線蟲AChE酶與ATP酶的比活力，具體操作步驟參照劑盒說明書。

2 結果與分析

2.1 BH0531發酵原液對松材線蟲形體的影響

線蟲經BH0531發酵原液處理后的形態觀察結果如圖1所示。圖1A為對照組觀察到的活體線蟲，線蟲體態自然，呈S型，蟲體內容物分布均勻，結構完整。經BH0531發酵原液處理16 h后，蟲體體態嚴重扭曲、扭結，呈“&”型（圖1B）或“ω”形（圖1C），少部分蟲體僵直萎縮。處理32 h后，線蟲尾部彎曲成鉤狀（圖1D），個別蜷縮呈“o”型（圖1E），頭部腫脹（圖1F），最終成C形、新月形或直形死亡（圖1G）。

圖1 BH0531發酵原液對松材線蟲形體的影響Fig.1 Effect of BH0531 fermentation broth on the morphology of B.xylophilus

2.2 BH0531發酵原液對松材線蟲運動能力的影響

采用Leica光學顯微鏡對測試線蟲攝像1 min，測定線蟲每分鐘內扭動的次數，結果如圖2所示。由圖2可知，BH0531代謝物處理線蟲2 h時，運動頻率高的線蟲（≥40次/min）所占比例比對照增加了13.9%，表明經代謝物處理后，線蟲運動加快，處于興奮狀態。處理8 h后，處理組線蟲開始出現運動頻率≤10次/min的線蟲，表明線蟲的運動受到抑制。16 h后，處理組中高頻率的線蟲全部消失，中頻率線蟲減少為對照組的61.5%。處理32 h后，處理組的低頻率線蟲為對照組低頻率線蟲數量的8.26倍。

圖2 BH0531發酵原液對松材線蟲運動能力的影響Fig.2 Effect of BH0531 fermentation broth on the athletic ability of B.xylophilus

2.3 BH0531發酵原液對線蟲體內乙酰膽堿酯酶和總三磷酸腺苷（ATP）酶的影響

2.3.1 對線蟲乙酰膽堿酯酶（AChE）比活力的影響

圖3 BH0531發酵原液對松材線蟲AChE比活力的影響Fig.3 Effect of BH0531 fermentation broth on AChE activity of B.xylophilus

由圖3可知，松材線蟲乙酰膽堿酯酶對BH0531代謝物非常敏感，處理4 h內，AChE比活力急劇下降，由0.417 U/mg降至0.089 U/mg，僅為對照組的36.1%。處理后期，處理組線蟲AChE比活力始終低于對照組，差異顯著（P＜0.05）。結果表明，BH0531代謝物對松材線蟲AChE比活力有強抑制作用，致使線蟲神經傳導紊亂，過度興奮，中毒死亡。

AChE在線蟲的體壁肌細胞、咽肌細胞、肛門神經節和頭部神經元等部位都有表達，與神經遞質密切相關[13-14]。線蟲依靠體壁縱向排列的背肌帶和腹肌帶的收縮而獲得蠕行的動力，在線蟲的腹神經索和背神經索存在神經—肌肉突觸，需通過神經遞質乙酰膽堿來調節肌肉活動[15]。BH0531代謝物對松材線蟲AChE比活力有強抑制作用，使線蟲神經傳導受阻，無法終止興奮，肌肉痙攣，這與線蟲處理前期扭動頻率提升癥狀相符合。

2.3.2 對線蟲總ATP酶比活力的影響

圖4 BH0531發酵原液對松材線蟲ATP酶比活力的影響Fig.4 Effect of BH0531 fermentation broth on ATPase activity of B.xylophilus

由圖4可知，處理組線蟲三磷酸腺苷酶（adenosine triphos phatase，ATPase）在處理前期（2 h），酶比活力由0.447 U/mg升至0.501 U/mg，酶比活力升高了17%，隨著處理時間的延續又急劇下降至0.180 U/mg，下降為對照的59.1%。結果表明，ATP酶在處理前期（2 h）活力升高是用于滿足線蟲中毒后的信息傳遞和能量轉換等要求。隨著線蟲中毒時間延長，ATP酶比活力被抑制。

ATP酶存在于線蟲組織細胞及細胞器的膜上，在物質運輸、能量轉換以及信息傳遞方面具有重要作用。BH0531代謝物處理線蟲2 h，線蟲ATP酶比活力顯著升高，可能與線蟲過度興奮，呼吸與代謝加快有關。隨后，ATP酶活力降低，推測線蟲由于肌肉麻痹，扭動頻率減小，各項機能減退，所需能量減少。

3 結論

研究了海洋來源的枝頂孢霉（Acremoniumsp.BH0531）代謝物對松材線蟲形態變化、運動能力及重要酶類的影響，從線蟲表觀效應和酶學變化等不同角度探究該菌殺線蟲作用的可能機理，為該菌進一步開發成為植物寄生線蟲生防治劑奠定實驗室基礎。結果表明，BH0531代謝物的殺線蟲機制與有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的機制類似，AChE可能是BH0531代謝物殺線的靶標之一，而ATP酶的變化則可能是由中毒癥狀引發，并非BH0531代謝物的直接作用靶標。

酶活性測試表明，該菌代謝物對松材線蟲體內的乙酰膽堿酯酶AChE具較強抑制作用，酶比活力由0.417 U/mg降至0.089 U/mg；ATP酶活力先升高后下降，處理2 h酶比活力由0.447 U/mg升至0.501 U/mg，隨著時間的持續又急劇下降至0.180 U/mg左右。這兩種酶活力的變化情況與線蟲處理后運動頻率變化的觀察結果相一致。

根據BH0531殺線活性代謝物水溶性好、分子質量小、熱穩定性好等特點，可推斷BH0531代謝物主要殺線蟲活性成分可能為含氮糖類或含氮糖類衍生物。由于BH0531代謝物成分尚未確定，殺線機理尚有待進一步深入研究。

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