鹽漬蘿卜色差值測定及其提取物抑菌活性研究

王雅娟，李 健，2，周常義，2，蘇國成，2，3*

（1.集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門市食品科技研發檢測中心，福建 廈門 361021；3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021）

白蘿卜（Raphanus sativusL.）為十字花科屬根用蔬菜，具有刺激性辛辣味，可以鮮食，也可以加工成各種干制品、腌制品、鹽漬品。在日本，鹽漬白蘿卜因其香鮮可口、色澤誘人已成為人們餐桌上必備的傳統佳肴，約占日本加工蔬菜市場的60%[1-2]。

“老菜脯”是福建省閩南地區的一種傳統鹽漬食品，因其貯藏時間長又稱為“老蘿卜干”，由白蘿卜加鹽經多次反復搓、曬、壓工序，除去大部分水分，收于壇內貯藏制得。老蘿卜干外觀黑亮，香味獨特，貯藏時間可達十幾年。陳年老蘿卜干具有清涼降火、增進食欲、健脾化滯、潤腸通便等作用，有“賽人參”、“胃腸藥”之說。日本在20世紀70、80年代就開始了對鹽漬蘿卜的研究，主要集中于鹽漬過程中黃色素的形成機制及其中間產物如3-（羥基）甲烯基-2-硫代吡咯烷、2-硫代-3-吡咯烷醛、1-（2-硫羰吡咯烷-3-基）-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸和終產物如2-[3-（2-硫代吡咯烷-3-內鎓烯）甲基]-色氨酸（TPMT）的結構及其抗氧化、抗誘變等生理功能方面[3-9]。對于鹽漬蘿卜的抑菌活性，研究較多的是短期（不足一年）腌制產品中辣味物質降解產物的抗菌活性[7，9]，然而關于腌制時間超過一年的鹽漬蘿卜提取物的抗菌活性卻未見報道。本研究以色差值為腌制時間依據，研究了不同腌制年數鹽漬蘿卜提取物的抗菌活性，為“老菜脯”這種福建閩南傳統鹽漬食品的開發利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽漬蘿卜：福建省漳州市漳浦縣；新鮮白蘿卜：廈門市集美菜市場；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）：集美大學微生物實驗室；LB瓊脂培養基、LB肉湯培養基、孟加拉紅培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、酵母膏胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：廣東環凱微生物科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：生工生物工程（上海）有限公司；兩性霉素B（純度＞750 mcg/mg）：南京匯百侍生物科技有限公司；硫酸鏈霉素（92%）：深圳華藥南方制藥有限公司；甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

WSC-S測色色差計：上海精密科學儀器有限公司；WK-1600A型高速藥物粉碎機：青州市精誠機械有限公司；RE-52A型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-4型數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；HWY-2112型雙層恒溫培養搖床：廈門德維科技有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鹽漬蘿卜顏色值的測定

將新鮮白蘿卜及不同腌制時間的鹽漬蘿卜切片（3～5 mm），取不同部位蘿卜6片，用直徑3 cm的模具切成圓形備用，儀器開機預熱30 min后，用黑阱和白板（L*=91.86，a*=-0.88，b*=1.42）校正后進行測定，以新鮮白蘿卜的各顏色值作為對照，記錄各個年數鹽漬蘿卜的L*、a*、b*值（白蘿卜的記為L0*、a0*、b0*），6次測量求平均值。色差值（△E*ab）按如下公式計算[10]。

式中：L*表示明度，數值從0到100，表示顏色由黑到白；a*值和b*值表示顏色的彩度，+a*表示紅色，-a*表示綠色；+b*表示黃色，-b*表示藍色，值的大小表示色調的強弱程度[11]。

1.3.2 鹽漬蘿卜抑菌活性的測定

（1）有機溶劑選取

將新鮮白蘿卜以及不同腌制年數鹽漬蘿卜切碎，于50 ℃條件下烘干，粉碎，過20目篩，得蘿卜粉末。稱取10年鹽漬蘿卜以及白蘿卜粉各5份，每份5 g，置于300 mL三角瓶中，分別加入100 mL水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚，封口后置于40 ℃恒溫水浴鍋中，浸提過夜，抽濾，除去殘渣，收集濾液，旋轉蒸發除去溶劑。將得到的浸膏用少量相應溶劑溶解后轉移至5 mL具塞刻度試管中，加溶劑至2.5 mL，配成等濃度溶液備用（相當于蘿卜干粉2 g/mL）。以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母作為指示菌，采用濾紙片法和牛津杯法進行抑菌試驗，以1 mg/mL硫酸鏈霉素（溶于生理鹽水）和0.5 mg/mL兩性霉素B（溶于DMSO）作為陽性對照，并做各溶劑的空白對照。細菌于37 ℃培養18～24 h（酵母菌于30 ℃條件下培養24～48 h）后觀察抑菌圈，并繼續培養至7 d，期間間歇觀察抑菌圈的大小。選取對3種菌的抑菌圈直徑均較大且清晰的粗提物提取溶劑作為后續試驗中抗菌活性物質的提取溶劑。

（2）抑菌活性物質提取

稱取已烘干粉碎的1年、3年、5年、10年、15年、20年鹽漬蘿卜粉各2份，每份20 g，將其分為2組，每組均含各年數鹽漬蘿卜1份。按料液比1∶10向其中一組中加入丙酮，另一組加入乙酸乙酯，40 ℃恒溫水浴浸提過夜，抽濾，收集濾液，殘渣按料液比1∶5加入丙酮或乙酸乙酯浸提12 h，合并濾液，40 ℃真空減壓濃縮。濃縮液用相應提取溶劑定容至10 mL（相當于蘿卜干粉2 g/mL），轉移至具塞刻度試管中，

4 ℃貯存備用。

（3）體外抑菌試驗

（a）菌懸液的制備：用接種環分別挑取1環大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌（3種菌分別代表了3大類微生物即革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌，它們也是食品中較常見的腐敗菌）斜面培養物接種至LB肉湯培養基（釀酒酵母接種至YPD液體培養基）中，于37 ℃、180 r/min搖床中培養12 h（酵母菌于30 ℃靜置培養12 h）。經平板計數后，此條件下得到的培養物其細菌菌落總數約為107～108CFU/mL，酵母菌菌落總數約為105～106CFU/mL。

（b）不同腌制時間鹽漬蘿卜體外抑菌試驗：向已滅菌冷卻至45 ℃左右的300 mL LB瓊脂培養基（釀酒酵母用PDA培養基）中加入制備好的菌懸液5 mL，振蕩混勻，之后再加入200 mL同樣培養基，再次振蕩使菌液充分分散至培養基中，迅速將培養基倒入已紫外殺菌的平板中，用滅菌涂布棒輕輕將氣泡趕至平板邊緣。待培養基完全凝固后，放置牛津杯，向牛津杯中分別加入200 μL各年數鹽漬蘿卜的乙酸乙酯、丙酮提取物，蓋好皿蓋，于超凈臺中在風機打開狀態下靜置2 h，使活性物質擴散并揮發大部分有機溶劑。隨后將平板置于37 ℃（釀酒酵母于30 ℃）條件下培養18～24 h（釀酒酵母24～48 h）。以1 mg/mL硫酸鏈霉素（釀酒酵母用0.5 mg/mL兩性霉素B）作為陽性對照，并做乙酸乙酯、丙酮的空白溶劑對照。用游標卡尺測量抑菌圈直徑，3次測量取平均值。每種菌每種提取物均做3個平行，抑菌圈直徑取3個平行的平均值。

1.4 數據處理

蘿卜的各顏色值（L*，a*，b*）以及抑菌圈直徑結果表示為平均數±標準偏差。數據統計分析采用SPSS statistics 17.0軟件程序進行，采用單因素方差分析和Duncan檢驗進行統計學檢驗（置信水平P=0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同腌制時間鹽漬蘿卜顏色值的測定結果

不同腌制時間鹽漬蘿卜顏色值的測定結果如表1所示。鹽漬蘿卜總色差值、亮度值、紅綠值、黃藍值隨腌制時間的變化分別見圖1～圖4。

表1 不同腌制時間鹽漬蘿卜顏色值測定結果Table 1 Color values of preserved radishes with different storage time

圖1 鹽漬蘿卜總色差值Fig.1 △E＊abvalue of preserved radish

圖2 鹽漬蘿卜亮度值Fig.2 L＊ value of preserved radish

圖3 鹽漬蘿卜紅綠值Fig.3 a＊ value of salted radish

圖4 鹽漬蘿卜黃藍值Fig.4 b＊ value of salted radish

從表1可看出，不同腌制時間鹽漬蘿卜各顏色值之間存在顯著差異，總色差值△E*ab隨腌制時間延長整體呈上升趨勢，這表明鹽漬蘿卜的顏色隨腌制時間延長逐漸加深。從圖1可看出，鹽漬蘿卜在腌制最初的1年中，色差值變化最大，這是因為在腌制初期，蘿卜中的芥子油苷在芥子酶作用下降解生成辣味物質4-甲硫基-3-丁烯基異硫氰酸酯，在有L-色氨酸（L-Trp）、VC、鄰苯二酚等的存在條件下發生一系列復雜反應生成黃色物質，使白蘿卜發生由淺黃色到暗黃色的明顯變化[9，12]，而在隨后的幾個時間段，色差值變化相對較小，這可能是因為黃變發生以后，鹽漬蘿卜顏色的進一步加深需要一定的底物積累且反應發生緩慢，因此，在較長的時間段（3～5年）內，顏色變化沒有最初的1年內明顯，鹽漬蘿卜腌制過程中顏色變化的深層次原因還有待于進一步研究。另外，從圖2～圖4可看出，白蘿卜的明度值（L*值）最大，彩度（a*值和b*值）偏向于黃綠色，隨著腌制時間的延長，L*值逐漸減小，a*值和b*值整體上呈現先上升后下降的趨勢，因而出現了表1所示的鹽漬蘿卜由暗黃到黑的顏色變化。

2.2 鹽漬蘿卜提取物抑菌結果

2.2.1 不同溶劑提取物抑菌結果

經體外抑菌試驗，牛津杯法和濾紙片法得到的試驗結果如表2所示，從表2可以看出，白蘿卜的水、甲醇、乙醇提取物對2種細菌有抑菌效果而對釀酒酵母沒有，石油醚提取物對3種菌均無抑菌效果，這與ABDOU I A等[13]的研究結果一致，但BEEVI S S等[14]對白蘿卜提取物的抑菌實驗結果表明，白蘿卜的丙酮提取物對枯草芽孢桿菌有抑菌作用，另外，在HU S H等[15]對十字花科蔬菜提取物的抗菌研究中，白蘿卜的水提物與甲醇-水提物不僅對細菌有一定抑菌效果，對假絲酵母也表現較好地抑菌活性，這與本試驗結果有所不同，原因可能是本實驗中白蘿卜的干燥是采用鼓風干燥而非冷凍干燥方式，會造成白蘿卜中抑菌活性物質的損失，COOGAN R C等[16]的研究表明，在50 ℃條件下，熱風干燥白蘿卜片，當其水分含量＜10%時，損失的4-甲硫基-3-丁烯基異硫氰酸酯（4-methylthio-3-butenyl isothiocyanate，MTBITC）約是冷凍干燥的5倍。而MTBITC不僅是白蘿卜主要的風味物質成分，也是其抑菌活性物質的主要來源[17]。本實驗中，對于鹽漬蘿卜，丙酮提取物、乙酸乙酯提取物在所使用的兩種抑菌實驗方法中均對3種指示菌具有較好的抑菌作用；甲醇、乙醇提取物在牛津杯法試驗中，對2種細菌有一定的抑菌效果，但在濾紙片法試驗中沒有抑菌效果；而石油醚提取物在兩種方法中均無抑菌效果。不同溶劑提取物在抑菌效果上的差異可能是由各溶劑對不同抑菌活性成分的溶解度不同所致[17-21]；此外，鹽漬蘿卜的甲醇、乙醇提取物的抑菌活性在抑菌方法上的差異性可能是因為活性物質在兩種溶劑中溶解度較小，濾紙片上活性物質的吸附量不足但本身又存在部分保留而減少了其在瓊脂平板表面的擴散[22]，因而不能產生清晰可見的抑菌圈。另外，ELOFF J N等[23]對抑菌活性物質提取分離所選用溶劑的研究結果也表明，丙酮和乙酸乙酯無論是在提取率、活性物質的提取種類還是在生物毒性、去除的難易程度上都優于二氯甲烷、乙醇、甲醇等溶劑。因此，本實驗選取丙酮和乙酸乙酯作為抑菌活性物質的提取溶劑。

表2 不同溶劑提取物的濾紙片法和牛津杯法抑菌結果Table 2 Antimicrobial activity of different solvent extracts against Bacillus subtilis, Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae by paper filtering and cylinder-plate method

表3 不同腌制年數鹽漬蘿卜乙酸乙酯、丙酮提取物抑菌結果Table 3 Antimicrobial activity of ethyl acetate and acetone extracts of preserved radishes with different storage time

2.2.2 不同年數鹽漬蘿卜的丙酮、乙酸乙酯提取物抑菌結果

不同年數鹽漬蘿卜的丙酮、乙酸乙酯提取物的抑菌結果如表3所示，由表3可知，鹽漬蘿卜的丙酮和乙酸乙酯提取物對3種指示菌均有較好的抑菌效果，丙酮提取物的抑菌效果整體好于乙酸乙酯提取物，兩種提取物對細菌和真菌的抑菌效果存在一定差異性，這種菌種間抑菌效果差異的原因可能是不同微生物細胞類型不同以及其對抑菌活性物質的敏感度差異造成的[24]。除腌制時間為3年的鹽漬蘿卜提取物之外，其余年數鹽漬蘿卜的乙酸乙酯提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌效果好于大腸桿菌，這是因為相比于革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌外膜的滲透阻礙性限制了抑菌劑與靶目標的接觸[25]；除腌制時間為1年的鹽漬蘿卜外，其他年數鹽漬蘿卜的丙酮提取物對兩種細菌的抑菌效果沒有顯著差異。

另外，腌制時間為1年、3年、5年的鹽漬蘿卜的乙酸乙酯提取物抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌效果明顯好于腌制時間為10年、15年、20年的，這可能與乙酸乙酯提取物中的某些抑菌活性物質的化學穩定性有關[26-27]；與乙酸乙酯提取物有所不同的是，腌制時間為1年、5年、20年鹽漬蘿卜的丙酮提取物抑菌效果較好，而腌制時間為3年、10年、15年的相對次之，這可能是由不同年數鹽漬蘿卜中特定抗菌活性物質的種類以及數量的差異造成的，造成這種差異的原因還有待于進一步研究。腌制時間20年的鹽漬蘿卜丙酮提取物對兩種細菌的抑菌圈直徑分別可達18.40 mm和18.10 mm，與陽性對照的18.86 mm和18.82 mm接近，具有很好的抗菌潛力。對釀酒酵母的抑菌結果中，腌制時間為3年和10年的兩種鹽漬蘿卜提取物的抑菌效果好于腌制時間為1年和5年的，而腌制時間為15年和20年的兩種鹽漬蘿卜提取物均無明顯抑菌效果，且除腌制時間為1年的提取物外，丙酮提取物的抑菌效果均好于12.70 mm的陽性對照，這表明鹽漬蘿卜的丙酮提取物具有較好的抑真菌能力。

3 結論

實驗以不同腌制年數鹽漬蘿卜為研究對象，以其顏色變化作為腌制時間依據，考察了不同腌制時間鹽漬蘿卜取物對兩種細菌、一種酵母菌的抑菌效果。實驗結果表明，不同腌制時間的鹽漬蘿卜在顏色值上存在顯著差異，總色差值總體呈上升趨勢，這表明隨腌制時間延長，鹽漬蘿卜的顏色在逐漸加深。通過抑菌試驗發現，相較于白蘿卜而言，多數鹽漬蘿卜的丙酮和乙酸乙酯提取物對3種指示菌具有良好的抑菌效果；不同提取物對不同菌種的抑菌效果存在差異；丙酮提取物的抑菌效果整體上好于乙酸乙酯，且多數提取物對酵母菌的抑菌效果好于陽性對照，但只有腌制時間為20年的鹽漬蘿卜，其對細菌的抑菌效果與陽性對照相近。腌制時間在10年以內的鹽漬蘿卜乙酸乙酯提取物對細菌的抑菌效果好于10年以上的。造成不同年數鹽漬蘿卜提取物抑菌效果差異的原因以及起主要作用的抑菌活性成分還有待于進一步研究。

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