基于酶活性調節的釀酒酵母谷胱甘肽發酵調控研究

方聰明，劉聯杰，周安盛，杜 馨，林建國，蔡 俊*

（湖北工業大學 發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068）

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是生物體中廣泛存在的非蛋白質巰基類三肽化合物，作為一種特殊的肽類，其在真核細胞中占主要地位[1]。GSH在很多的生化過程中起作用，它具有抗氧化、解毒、參與蛋白質修飾及機體內物質轉運等功能，這些生理活性作用使其在醫藥、食品及美容等行業有著很大的應用價值及潛力[2]。在細胞內谷胱甘肽經兩步酶催化反應而生成，其中第一步反應中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS，EC 6.3.2.2）由GSH1基因編碼合成，并且γ-GCS的活性受GSH的反饋抑制[3-4]。目前生產GSH的主要方法為微生物發酵法，主要利用釀酒酵母和產朊假絲酵母來生物合成[5]。提高酵母細胞內GSH的含量及細胞的生物量是研究中兩個主要的指標。生物量的提高是通過高密度發酵來實現，補料分批發酵是進行高密度發酵重要手段，而胞內的GSH含量的提高需首先選育高產GSH的菌種[6-7]，再通過生理環境調節來提高。為了提高這兩個指標，很多文獻報道研究了發酵培養條件及培養基成分[8-11]、發酵方式[12-13]、前體物質的補加[14-15]和生理環境脅迫[16]等，但GSH產量仍不高，發酵成本較高，無法工業化大規模生產。本實驗在研究了GSH合成關鍵酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶活特征的基礎上，對補料分批發酵中pH控制和溫度進行實驗優化，來提高釀酒酵母發酵中GSH的產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

高產谷胱甘肽釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeCCCG：發酵工程教育部重點實驗室保藏。

1.1.2γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

由本實驗室通過含GSH1基因表達質粒的大腸桿菌工程菌誘導表達并分離純化而制得。具體方法：將大腸桿菌工程菌E.coliBL21（pGEX-GSH1）在LB培養基中經異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）誘導培養，收集菌體，超聲波破碎，離心取上清液，過GST-Resin柱，并在層析柱上切除谷胱甘肽轉移酶（glutathione S-tranferase，GST）標簽，最后獲得GSH1重組蛋白，-20 ℃保存。

1.1.3 主要試劑

GSH（分析純）、庚烷磺酸鈉（分析純）、三磷酸腺苷酸鈉（分析純）：美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純）：美國Amresco公司；預裝1mL GST-Resin 重力柱：上海生工生物工程公司；其他試劑均為分析純并購于上海國藥集團。

1.1.4 培養基

大腸桿菌培養基（LB培養基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，固體培養基加入20 g/L 瓊脂，pH 7.0 左右，121 ℃下滅菌20 min。

釀酒酵母菌種斜面活化培養基（YPD培養基）：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，20 g/L瓊脂，pH 6.0左右，115 ℃下滅菌30 min。

一級、二級種子液培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，20 g/L瓊脂，pH 6.0，115 ℃下滅菌30 min。

發酵培養基：酵母粉100 g溶于9 L水（成分A）；糖蜜（含可發酵性糖28%）8 L（成分B）；葡萄糖840 g 溶于3 L 水中（成分C）；（NH4）2SO4264 g、NH4H2PO435 g 溶于700 mL水中（成分D），所有各成分121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

30 L Biostat C plus發酵罐：德國貝朗（B.Braun）公司；LC-20AD HPLC系統：日本島津（Shimadzu）公司；Inertsi ODS-SP色譜柱：島津技邇公司（GL sciences）。

1.3 方法

1.3.1γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的測定[17]

在1 mL體系中進行γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的測定，緩沖液體系100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0），體系中含有20 mmol/L谷氨酸鈉、10 mmol/L L-半胱氨酸、5 mmol/L三磷酸腺苷酸二鈉、100 mmol/L NaCl、20 mmol/L MgCl2及適量的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，將反應體系置于37 ℃水浴振蕩處理30 min，最后加入質量分數10%三氯乙酸0.1 mL終止反應，并離心處理。取離心后的上清液利用磷鉬藍法測定反應過程中產生的無機磷量。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活定義：在一定條件下，單位體積（mL）酶液在單位時間（h）內催化生成1 μmol無機磷的量為一個酶活單位（U）。

1.3.2γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶學特性的分析

根據酶活的測定方法，改變緩沖液體系的反應pH（其變化從6.0至11.0），研究pH對γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影響。同樣改變緩沖液體系的反應溫度（其變化從25 ℃到45 ℃），研究溫度對γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影響。

1.3.3 菌種活化及種子液培養條件

固體斜面試管30 ℃恒溫箱中培養。一級種子液：用接種環取一環已活化好的菌種接入25 mL種子培養基250 mL三角揺瓶中，30 ℃、200 r/min恒溫搖床培養18 h。二級種子液：用移液槍吸取10 mL 新鮮的一級種子培養液接入裝有100 mL種子液的1 000 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min恒溫搖床培養12 h。

1.3.4 發酵罐流加發酵的控制

發酵開始發酵罐中只有發酵培養基成分A，經過滅菌后培養基體積約為10 L，按10%的接種量接入培養好的二級種子，發酵過程中采用分階段控制策略，發酵前期流加糖蜜（成分B），當菌體濕質量達到150 g/L左右時，開始流加葡萄糖（成分C）至菌體濕質量達到210 g/L 左右時，同時整個過程中一開始就流加氮源（成分D）至加完為止。在這個過程中通過控制轉速、通氣量、碳源和氮源的流加速度來控制酒精的含量（0.1%vol～0.5%vol）和溶氧量，同時通過酒精的含量來反饋調節碳源的流加速度。發酵過程中的pH用10%稀硫酸和10%的碳酸鈉來調節。

1.3.5 細胞生物量測定

取一定體積發酵液5 000 r/min，離心10 min，用去離子水洗滌2次并收集菌體，置于105 ℃烘干至質量恒定，精確稱質量，減去離心管干質量即得到酵母的菌體干質量（dry cell weight，DCW）。

1.3.6 發酵液中酒精含量的測定

采用馬丁儀微量測定法[18]：準確移取0.05 mol/L酸性重鉻酸鉀溶液10.0 mL 于球形接收器中，移取10.0 mL 0.06 g/L氫氧化鈉溶液倒入隔離管中并加入1.0 mL發酵液，接好儀器加熱蒸餾，以沸騰時開始記時，蒸餾5 min。停止后用少量蒸餾水沖洗連接管口，取下接收器迅速冷卻至室溫，將接收器中的液體全部收集到250 mL三角瓶中，加入2 mL碘化鉀溶液及1 mL淀粉指示液，用1.0 mol/L硫代硫酸鈉標準液滴定至綠色為終點。

式中：X為乙醇含量，%vol；C為硫代硫酸鈉標準溶液的濃度，mol/L；V1為空白試驗消耗的硫代硫酸鈉標準液量，mL；V2為試樣消耗的硫代硫酸鈉標準液量，mL；V3為加入馬丁儀中的樣品體積，mL；N 稀釋倍數；常數0.014 6為1.00 mL 1.0 mol/L硫代硫酸鈉標準液相當于乙醇的量。

1.3.7 谷胱甘肽的提取

取一定量的濕菌體于離心管中，加入適當的pH=3.0鹽酸溶液，充分振蕩至菌體細胞分散均勻并放置冰上處理5 min，再將其放在95～100 ℃下水浴5 min，然后迅速在冰上冷卻，再取部分懸液12 000 r/min離心2 min，取離心后的上清液進行GSH的檢測。

1.3.8 谷胱甘肽的液相色譜檢測

采用LC-20AD液相色譜（HPLC）系統進行檢測操作。色譜柱：Inertsi ODS-SP（150 mm×4.6 mm×5 μm）；流動相：磷酸緩沖液與甲醇95∶5（V/V），其中磷酸鹽緩沖液為50 mmol/L KH2PO4溶液，內含10 mmol/L庚烷磺酸鈉，并用磷酸將緩沖液pH值調至3.0；檢測波長：210 nm；UV檢測器SPD-20A；流速1.0 mL/min；上樣量20 μL。

2 結果與分析

2.1 pH和溫度對γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活性的影響

圖1 pH(A)和溫度(B)對γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的影響Fig.1 Effect of pH (A) and temperature (B) on the activity of γ-GCS

對γ-GCS進行酶活分析，得到的結果如圖1所示。由圖1A可知，γ-GCS催化反應的最適pH為8.5左右，在pH 6.5～8.5的范圍內增幅很大。由圖1B可知，溫度對于γ-GCS的影響是明顯的，在25～35 ℃其酶活性逐漸增高，其酶活最適溫度為35 ℃左右。

2.2 谷胱甘肽的液相色譜檢測

GSH標準品HPLC檢測結果如圖2所示，釀酒酵母CCCG細胞提取的上清液HPLC檢測結果如圖3所示。

圖2 GSH標準品HPLC檢測結果Fig.2 HPLC result of standard GSH

圖3 釀酒酵母CCCG細胞提取的上清液HPLC檢測結果Fig.3 HPLC result of the extract supernatant of Saccharomyces cerevisiae CCCG

由圖2可知，標準GSH在HPLC檢測下的保留時間為4.6 min。由圖3可知，在4.6 min左右有明顯的峰，與左右雜峰有很好的分離度，可以確定圖3中10號峰為GSH特征峰，實驗中所用HLPC方法可以檢測出樣酵母細胞抽提液中的GSH含量。

2.3 初始發酵條件下實驗結果

圖4 初始發酵條件下各控制參數的變化曲線Fig.4 Curve of all fermentation parameters in initial condition

圖5 初始發酵條件下菌體生物量、胞內GSH含量與GSH產量的變化曲線Fig.5 Curve of cell biomass,intracellular GSH content and GSH yield in initial condition

在初始條件下進行發酵，其過程中的各參數控制如圖4所示。由圖4可知，發酵溫度控制在30 ℃恒定不變，其他參數可調節，發酵后期pH控制在4.5左右。整個過程中乙醇含量和溶氧量是限制性條件，控制發酵液中的乙醇含量在0.1%vol～0.5%vol范圍內，溶氧量下降到最低點后調節相關參數至其在5%左右。對于碳源的流加，先流加糖蜜，再加葡萄糖。氮源的流加過程發酵一開始就進行至其加完?？刂妻D速、通氣量來調節發酵液中的乙醇含量及溶氧。結果表明，在8～24 h內是各參數變化最大的時間，這一階段為菌體對數生長期，代謝旺盛。

圖5為初始發酵條件下菌體生物量、胞內GSH含量與GSH產量的變情況。由圖5可知，菌體生物量（干質量）在36 h達到最大，36～48 h內變化很小。而胞內GSH含量在42 h后才至達最大值，同時GSH產量也在這時候達到最高。發酵結束時，菌體生物量達到（40.70±1.31）g/L，胞內GSH含量為（19.10±0.36）mg/g，GSH產量為（777.37±18.57）mg/L。

2.4 在初始條件基礎上進行發酵pH調節的實驗結果

圖6 pH調節下各控制參數的變化曲線Fig.6 Curve of all fermentation parameters under pH control

圖7 pH調節下菌體生物量、胞內GSH含量與GSH產量的變化曲線Fig.7 Curve of cell biomass,intracellular GSH content and GSH yield under pH control

發酵過程中溫度、溶氧及發酵液中的乙醇濃度維持在初始條件的范圍內，進行發酵pH調節，發酵過程中各參數變化見圖6所示。由圖6可知，結合酶的最適pH值為8.0及其酶活在pH 6.5～8.5的范圍內增幅很大，同時也考慮到釀酒酵母生長適合的pH 范圍在4.0～6.0之間，發酵過程中0～24 h 內pH 維持在5.5～6.5之間，并在16～24 h逐漸調節到6.5左右，pH的調節可以通過流加堿液、碳源/氮源流加速度等來調節。圖7為發酵結束后菌體生物量、胞內GSH含量與GSH產量的變情況。由圖7可知，菌體生物量（干質量）在38 h達到最大，38～48 h內變化很小。而胞內GSH含量在36 h就達到最大值，同時GSH產量也在這時候達到最高。發酵結束時，菌體生物量達到（44.80±1.20）g/L，胞內GSH含量為（19.74±0.51）mg/g，GSH產量為（884.35±27.30）mg/L。與初始條件相比較，胞內GSH含量有些增高但變化不大，提高了3.35%，但GSH生物量及胞內GSH含量到達最大值的時間大大縮短，生物量增高了10.07%，最終GSH產量增高了13.76%。

2.5 在初始條件基礎上進行發酵溫度調節的實驗結果

圖8 溫度調節下各控制參數的變化曲線Fig.8 Curve of all fermentation parameters under temperature control

在初始條件的基礎上進行溫度優化實驗，其他參數pH值、發酵液中乙醇含量、溶氧控制在初始條件的范圍內，整個過程通過調節碳源/氮源的流加速度、通氣量、轉速等來維持，實驗中各參數變化情況如圖8所示。由圖8可知，結合酶的最適溫度在35 ℃左右，當溫度在35 ℃左右時γ-GCS酶的酶活達到最高，GSH合成第一步反應中獲得γ-谷氨酰半胱氨酸量更多，經二步反應后最終合成的GSH也更多。

圖9 溫度調節下菌體生物量、胞內GSH含量與GSH產量的變化曲線Fig.9 Curve of cell biomass,intracellular GSH content and GSH yield under temperature control

圖9為發酵48 h后菌體生物量、胞內GSH含量與GSH產量的變情況。由圖9可知，菌體生物量（干質量）在34 h達到最大，34～48 h內變化很小。而胞內GSH含量在42 h后才達最大值，同時GSH產量也在此時達到最高。發酵結束時，菌體生物量達到（46.30±1.55）g/L，胞內GSH含量為（19.84±0.44）mg/g，GSH產量為（918.59±29.22）mg/L。與初始條件相比較，胞內GSH含量提高了3.87%，GSH生物量及胞內GSH含量到達最大值的時間也和初始條件一致，但生物量增高了13.70%，最終GSH產量增高了18.17%。

3 結論

本研究開始以工程菌表達的釀酒酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶為對象，對其酶活特性進行分析，得出γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在體外最適的pH值及溫度。接著以γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶學特性為基礎，在釀酒酵母補料分批發酵產GSH的過程中進行pH值控制及溫度優化，補料分批培養過程中采用了同時控制碳源（葡萄糖、糖蜜）和氮源補加速度的流加方式，并在發酵過程嚴格監控發酵液中乙醇含量和溶氧。在初始條件的基礎上經pH值優化后，GSH產量達到最大的周期明顯縮短，胞內GSH的含量有一定提高，菌體生物量（干質量）和GSH產量有所提高。在溫度后優化實驗中，發現在溫度對菌體生物量的影響明顯，溫度從30～35 ℃后，菌體生物量（干質量）明顯提高，胞內GSH的含量也有一定提高，最終GSH產量有明顯提高。綜合pH值和溫度控制優化的結果來看，pH值和溫度不僅可以影響菌體的生物量，同樣對胞內GSH含量有一定的提高，這與胞內γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶活特性有一致性。

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