苦蕎紅曲保健酒的抗氧化活性

黃丹丹，周海媚，李 謠，杜木英，2*

（1.西南大學 食品科學學院，重慶 400716；2.西南大學 食品科學學院國家食品科學與工程實驗教學示范中心，重慶 400716）

苦蕎營養(yǎng)價值極高，含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素和礦物質等，更主要的是含有豐富的黃酮類和多酚類化合物，具有很好的抗氧化活性[1-9]。紅曲霉的應用在我國有悠久的歷史，長期以來被廣泛應用于食品著色、釀酒及制醋上。紅曲霉代謝產(chǎn)生的抑菌物質、酶類、Monacolin K和麥角固醇等多種生理活性物質，具有降低血清膽固醇、抑菌、防癌等保健功效[10-14]，而且紅曲味甘、性溫，可消食活血、健脾燥胃。

本研究利用前期實驗結果，以苦蕎和糯米為主要原料，經(jīng)紅曲、酵母發(fā)酵研制成苦蕎紅曲保健酒，為研究其抗氧化功能，測定了苦蕎紅曲保健酒中總黃酮、總酚的含量，研究了其體外抗氧化能力，并與普通市售黃酒、VC、水溶性維生素E（Trolox）進行對比，同時分析了總黃酮、總酚含量與抗氧化能力之間的相關性，以期為苦蕎紅曲保健酒的開發(fā)與深加工提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎紅曲保健酒：西南大學食品科學學院實驗室自制；黃酒：市售紹興會稽山五年陳釀黃酒；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）、2,4,6-三 吡 啶基三嗪（2,4,6-tripyridyl-triazine，TPTZ）、Trolox 均為分析純：美國Sigma公司；蘆丁標準品、沒食子酸：中國藥品生物制品檢定所；福林酚：北京索萊寶科技有限公司；VC、濃鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、三氯化鐵、冰乙酸、乙酸鈉、無水乙醇、過硫酸鉀、碳酸鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

FA1004A型分析天平：上海精天電子儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-1240型紫外分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎紅曲保健酒的制備

苦蕎和糯米原料配比為1∶1.5，糯米蒸熟攤涼后與苦蕎混勻，按質量分數(shù)添加0.6%甜酒曲，于28 ℃糖化2 d后，再添加1‰酵母和12%的紅曲，于28 ℃發(fā)酵6 d。經(jīng)壓榨、煎酒后即得苦蕎紅曲保健酒。

1.3.2 總黃酮的測定[15]

（1）樣品的制備[16]

移取10 mL混合均勻的樣液到100 mL燒杯中，以0.1 mol/L NaOH調pH值至中性，再多加2滴，移入100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，備用。

（2）蘆丁標準曲線的繪制

準確稱取在105 ℃干燥至質量恒定的蘆丁20 mg置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)30%乙醇定容至刻度，搖勻。即得蘆丁質量濃度0.2 mg/mL的標準品溶液。分別取上述蘆丁標準溶液0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于10 mL具塞比色管中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min，加入2 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻后，加入體積分數(shù)30%乙醇至刻度，放置15 min后于510 nm波長處測吸光度值。以吸光度值為縱坐標，蘆丁質量濃度為橫坐標繪制蘆丁標準曲線，得到線性回歸方程：y=10.611x+0.003 1（R2=0.999 8）。

（3）樣液測定

取2 mL樣液2等份，分別置于10 mL具塞比色管中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min，加入2 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻后，加入體積分數(shù)30%乙醇至刻度，放置15 min后于510 nm波長處測吸光度值（以不加硝酸鋁作為空白）。

1.3.3 總酚的測定[17]

（1）沒食子酸標準曲線的繪制：稱取0.500 g沒食子酸用水定容于100 mL容量瓶中，制得5 mg/mL的標準酚溶液，分別吸取0、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL標準酚溶液于100 mL容量瓶中，用水定容，則酚質量濃度依次為0 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL、45 μg/mL、60 μg/mL、75 μg/mL。分別從其中吸取1 mL標準溶液，加4 mL水補至5 mL，再加入0.5 mL福林酚，充分搖勻30 s后，加入1 mL 7.5%碳酸鈉溶液，45 ℃條件下反應15 min后，在765 nm波長處測吸光度值，以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制沒食子酸標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.079 6x+0.007 8（R2=0.999 0）。

（2）樣液測定：實驗組加樣液0.05 mL、4.95 mL去離子水，空白組為5 mL水，向各管中加入0.5 mL福林酚，充分搖勻，30 s后加入1 mL 7.5%碳酸鈉溶液，45 ℃反應15 min，在765 nm波長處測吸光度值。

1.3.4 抗氧化活性的測定

（1）DPPH自由基清除率的測定[18]：稱取0.007 9 g DPPH標準品，用無水乙醇溶解后定容至100 mL容量瓶中，配制得0.2 mmol/L DPPH溶液，同時配制不同濃度梯度的樣液（無水乙醇稀釋）。吸取0.1 mL樣品溶液，加入3.9 mL DPPH溶液，暗處避光30 min后于517 nm波長處測吸光度值A1，用無水乙醇作參比。同時測定0.1 mL 無水乙醇與3.9 mL DPPH溶液混合后的吸光度值A2，以及0.1 mL樣品溶液與3.9 mL無水乙醇混合后的吸光度值A3，按以下公式計算DPPH自由基清除率，同時用紹興黃酒、0.4 mg/mL VC和0.8 mg/mL Trolox作對比。

（2）ABTS自由基清除率的測定[19]：將等量的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液混合避光放置12～16 h。用無水乙醇將該溶液稀釋至其在波長為734 nm處吸光度為0.7±0.02，得到ABTS自由基工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用），同時制備不同濃度梯度的樣液（乙醇稀釋）。吸取0.15 mL樣品溶液，加入2.85 mL ABTS自由基工作液，暗處避光10 min后734 nm波長處測定吸光度值A1，以無水乙醇為參比。同時測定0.15 mL無水乙醇與2.85 mL ABTS自由基工作液混合后的吸光度值A2，ABTS自由基清除率計算公式如下，同時用紹興黃酒、0.4mg/mL VC和0.8 mg/mL Trolox作對比。

（3）FRAP值的測定[20]：將300 mmol/L 醋酸鈉緩沖溶液（pH 3.6）、10 mmol/LTPTZ鹽酸溶液（鹽酸濃度40 mmol/L）、20 mmol/L FeCl3溶液按照10∶1∶1（V/V）混合制得FRAP工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

FeSO4標準曲線的繪制：配制不同濃度的FeSO4溶液（0、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L），吸取0.1 mL不同濃度FeSO4溶液，加入2.9 mL FRAP工作液，混勻，于37 ℃恒溫水浴10 min后在593 nm波長處測定吸光度值，以蒸餾水為參比。以吸光度值為縱坐標，F(xiàn)eSO4溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.754 2x+0.076 8（R2=0.999 6）。

樣品的測定：配制不同濃度梯度的樣液，吸取0.1 mL不同濃度樣品溶液，加入2.9 mL FRAP工作液中，混勻，于37 ℃恒溫水浴10 min后在593 nm波長處測定吸光度值，以蒸餾水為參比。樣品抗氧化能力以FeSO4濃度（即FRAP值）表示，同時用紹興黃酒、0.4mg/mL VC和0.8 mg/mL Trolox作對比。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有的實驗數(shù)據(jù)都是3次實驗的平均值，應用Excel和SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，用Origin 8.6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 總黃酮和總酚含量的測定結果

通過比色法測得苦蕎紅曲保健酒的吸光度值，由標準曲線相關方程得到總黃酮和總酚含量分別為1 011.02 μg/mL、1 569.80 μg/mL；市售黃酒的總黃酮和總酚含量為78.06 μg/mL、778.87 μg/mL。

2.2 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶劑中呈紫色，在517 nm波長處有最大吸收峰，當有自由基清除劑存在時，DPPH自由基的單電子被配對使其吸收逐漸消失，顏色變淺，且褪色程度與其接受的電子數(shù)成化學計量關系。因此，可以根據(jù)反應液在最大吸收波長處吸光度的大小來評價被測樣品抗氧化能力的強弱，吸光度值越小，被測樣品的抗氧化能力越強[21]。結果見圖1。

圖1 各樣品對DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of each sample on DPPH free radicals

從圖1可以看出，苦蕎紅曲酒、紹興黃酒、VC和Trolox對DPPH自由基均具有一定的清除能力，且苦蕎紅曲酒對DPPH自由基的清除能力明顯高于Trolox、VC和紹興黃酒。各樣品對DPPH自由基的清除能力隨著用量的增加而上升，其中苦蕎紅曲酒和Trolox對DPPH自由基的清除能力隨用量變化的增效明顯，而VC和紹興黃酒的各濃度梯度之間DPPH自由基清除率差異不顯著。樣品用量在40～70 μL之間變化時，除了紹興黃酒，其他3種樣品對DPPH自由基清除率與用量之間呈現(xiàn)較好的線性關系，結果表明苦蕎紅曲酒對DPPH自由基有較好的清除能力。

2.3 ABTS自由基清除能力的測定

ABTS經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS+，當加入的被測物質含有抗氧化成分時，該物質會與ABTS+發(fā)生反應使反應體系褪色，顏色變淺，在其最大吸收光波長734 nm下測定其吸光度值變化。根據(jù)吸光度值的大小判定被測樣品抗氧化能力的強弱，吸光度值越小，被測樣品抗氧化能力越強[22]，結果見圖2。

圖2 各樣品對ABTS自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of each sample on ABTS free radicals

從圖2可以看出，苦蕎紅曲酒、紹興黃酒、VC和Trolox對ABTS自由基均具有一定的清除能力，且苦蕎紅曲酒對ABTS自由基的清除能力明顯高于Trolox、VC和紹興黃酒。各樣品對ABTS自由基的清除能力隨著用量的增加而上升，其中苦蕎紅曲酒、Trolox和VC對ABTS自由基的清除能力隨用量變化的增效明顯，而紹興黃酒的各濃度梯度之間ABTS自由基清除率差異不顯著，結果表明苦蕎紅曲酒對ABTS自由基有很好的清除能力。

2.4 Fe3+還原能力的測定

FRAP法是基于氧化還原反應，在酸性pH值下，F(xiàn)e3+與TPTZ形成復合物（Fe3+-TPTZ），在被測物的還原物質作用下，復合物被還原為Fe2+而呈藍色，在593 nm波長處達到最大吸收，還原物質的含量與吸光度值的變化呈比例關系。因此，可用來判定物質的抗氧化能力，在593 nm波長處檢測吸光度值，吸光度值越大，F(xiàn)RAP值也就越大，被測樣品抗氧化能力越強[23]。結果見圖3。

圖3 各樣品對Fe3+的還原能力Fig.3 Reducing power of each sample on Fe3+

從圖3可以看出，苦蕎紅曲酒、紹興黃酒、VC和Trolox對Fe3+均具有一定的還原能力，說明4種被測物都含有一定的還原性物質。且苦蕎紅曲酒對Fe3+的還原能力明顯高于Trolox、VC和紹興黃酒。各樣品對Fe3+的還原能力隨著用量的增加而上升，其中苦蕎紅曲酒對Fe3+的還原能力隨用量變化的增效明顯。而Trolox、VC和紹興黃酒的各濃度梯度之間對Fe3+的還原能力差異不顯著。

2.5 總黃酮含量、總酚含量與抗氧化能力之間的關系

根據(jù)圖1～圖3測定結果，采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件，將苦蕎紅曲酒樣品的總黃酮含量和總酚含量與其抗氧化能力作相關性分析，結果見表1。

表1 樣品總黃酮、總酚含量與抗氧化相關性Table 1 Correlation between antioxidant activity and total flavonoids or total polyphenols

由表1可知，樣品中的總黃酮、總酚含量對DPPH自由基、ABTS自由基的清除率和對Fe3+的還原能力呈極顯著相關（P＜0.01），說明黃酮類物質、酚類物質對樣品抗氧化能力有顯著影響。

3 結論

本實驗測定了苦蕎紅曲保健酒中總黃酮和總酚的含量，并且對比了苦蕎紅曲保健酒、市售黃酒、VC、Trolox對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和對Fe3+的還原能力。結果表明，隨著被測樣液用量的增加，其抗氧化能力也在不斷增強。對相關性的分析表明，苦蕎紅曲保健酒黃酮及總酚含量與其對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和對Fe3+的還原能力之間存在極顯著差異。

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