蛇龍珠與卡曼娜葡萄酒主要呈香物質鑒定

蔡 建，朱保慶，蘭義賓，段長青*

（1.中國農業大學 食品科學與營養工程學院 葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083；2.北京林業大學 生物科學與技術學院，北京 100083）

蛇龍珠（Cabernet Gernischt）是我國主要釀酒葡萄品種之一，在山東煙臺及甘肅河西走廊等地區有廣泛種植，但其來源和品種的親緣關系問題在業內曾一直存在較大爭議。尹克林等[1]曾通過對葡萄品種葉形結構的多元判別分析提出蛇龍珠與赤霞珠并非同一品種，可能是源于法國的品麗珠（Cabernet Franc）。隨后羅國光[2]也推測蛇龍珠就是品麗珠，或可能是經過多年人工選擇下形成的品麗珠新品系。為了進一步揭示蛇龍珠的品種來源和親緣關系，姚玉新等[3-4]對蛇龍珠及其他釀酒葡萄品種進行隨機擴增多態性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術分析后均發現蛇龍珠、赤霞珠、品麗珠和美樂是4個獨立的品種，蛇龍珠都與品麗珠遺傳距離最近而與赤霞珠、美樂較遠。李玉霞等[5]則通過RAPD技術分析后證實，蛇龍珠與法國波爾多古老釀酒品種卡曼娜（Carménère）的遺傳距比品麗珠更近，并推斷蛇龍珠與卡曼娜可能就是同一品種（系），而非之前認為的品麗珠。李紅娟等[6]最近的研究也證實蛇龍珠與品麗珠并非同一品種。鐘曉敏等[7]研究了不同品系蛇龍珠與其他品種的親緣關系發現，蛇龍珠與卡曼娜的相似度達98.29%～100%，從而進一步證實了蛇龍珠與卡曼娜是同一品種。

蛇龍珠葡萄酒香氣具有典型的草本植物香氣，但與赤霞珠常有的青椒或甜椒氣味有所區別。目前國內已有一些利用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析蛇龍珠葡萄酒香氣物質組成的報道，但由于檢測方法定性定量準確性的限制，對該品種葡萄酒特征香氣物質組分的研究結果仍不明確。李華等[8]在蛇龍珠葡萄酒中檢測出苯乙醇等29種揮發性風味物質，但并未對其這些物質進行精確定量。張明霞等[9]對蛇龍珠、赤霞珠和品麗珠3個單品種葡萄酒的香氣組成進行了定性定量分析，并結合香氣閾值對這些物質對香氣的貢獻進行評估。該研究在蛇龍珠葡萄酒中共檢測出50種揮發性物質，其中主要呈香物質種類與赤霞珠和品麗珠類似，主要為辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸異戊酯3種物質。姜文廣等[10]對蛇龍珠和美樂葡萄酒香氣組成進行了研究，并在其中分別鑒定出75和82種揮發性物質，但僅對其進行了相對定量。李霞等[11]在蛇龍珠葡萄酒中共檢測出57種揮發性物質，并對其進行了定量，同時還發現浸漬酶可增加蛇龍珠葡萄酒中部分萜烯類物質的含量。尹建邦[12]首次利用氣相色譜-嗅覺測量法（GC-O）技術和香氣活性值（odor activity value，OAV）對蛇龍珠葡萄酒特征香氣組分進行了鑒定，發現辛酸乙酯、己酸乙酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯、異戊酸和β-大馬士酮是該品種的主要呈香物質。

卡曼娜雖然為法國波爾多地區的本土品種，但在19世紀末根瘤蚜侵害歐洲葡萄園后，在波爾多地區的種植面積就很少了。目前該品種主要栽培地區在智利，并有大量以該品種釀造的單品種優質葡萄酒。同蛇龍珠類似，卡曼娜葡萄酒的香氣中也有一種淡淡的植物氣息，但由于在智利其成熟度較好，這種植物氣息相對于我國的蛇龍珠而言相對較弱，更多的是呈現一些深色水果的香氣。因此，本研究以我國河西走廊地區的蛇龍珠葡萄酒和智利的卡曼娜葡萄酒為研究對象，試圖通過其香氣物質分析找出這一共同源自法國的葡萄品種在兩種氣候模式下所釀造出葡萄酒的特征香氣物質的異同。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛇龍珠干紅為2009年份釀造，原料產自甘肅高臺，蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）結束后入法國新橡木桶（中度烘烤）陳釀12個月，瓶儲1年后進行檢測。卡曼娜干紅為2010年釀造，產自智利莫萊山谷（VALLE DEL MAULE）開瓶后立即進行檢測。每個樣品重復檢測3次后取平均值。

香氣物質標樣及純度、生產商與參考文獻[13]相同。

1.2 儀器與設備

50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭、固相微萃取裝置：美國Supelco公司；6890-5975型氣質聯機、HP-Innowax色譜柱（60m×0.25mm×0.25μm）：美國Agilent公司；Sniffer 9000型嗅聞儀：瑞士Brechbuhler公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 頂空-固相微萃取條件

稱取1.0g NaCl放入15mL樣品瓶，依次加入磁力攪拌子（長0.5cm）、5mL葡萄酒樣品、10μL內標（4-甲基-2-戊醇水溶液，2.004mg/L），迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子密封，置于磁力加熱攪拌臺上加熱攪拌30min，然后將活化后的頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）萃取頭插入樣品瓶頂空部分，40℃繼續加熱攪拌30min。取下萃取頭，立即在GC進樣口（250℃）解析8min。

1.3.2 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：采用HP-Innowax色譜柱，載氣為高純氦氣，流速1mL/min；進樣口溫度為250℃，采用不分流進樣模式，解析時間8min；升溫程序為50℃保持1min，然后以3℃/min升溫至220℃，保持5min。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度為230℃，電離能為70eV，四級桿溫度為150℃，質譜接口溫度為280℃，質量掃描范圍為29～350m/z。

1.3.3 化合物定性定量

化合物的定性采用自動質譜解卷積和鑒定系統（automated mass spectral deconvolution&identification system，AMDIS）軟件結合已建立的葡萄酒香氣物質檢索譜庫對GC-MS全掃描數據文件進行解卷積分析，AMDIS參數設定與參考文獻[14]相同。自動質譜圖解卷積和鑒定系統（AMDIS）是美國標準化委員會推出的一款輔助GC-MS數據定性分析的軟件，利用該軟件可有效的克服GC-MS定性分析中基質效應和共洗脫效應的干擾，增加解譜的準確性和可靠性[14]。在定性過程中，根據各物質的保留時間計算相應的保留指數（retention index，RI）。將該組分的RI同標樣RI、質譜圖及美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）Chemical WebBook

中收錄的wax類型柱條件下測得的RI比較，差值絕對值小于50的組分可定性為該化合物?；衔锒糠椒皹藰有畔⑴c參考文獻[13]相同，對于已有標樣的物質，利用其對應的標準曲線定量。對沒有標樣的物質利用化學結構、官能團相似、碳原子數相近的標樣香氣物質的標準曲線定量。

1.3.4 香氣活性值（OAV）計算

香氣活性值（OVA）（簡稱香氣值）是評價葡萄酒揮發性組分對實際香氣貢獻大小所普遍采用的一個指標，目前國內外已有許多研究者應用該指標對葡萄酒揮發性組分的香氣貢獻進行評價，或使用該指標來尋找某種葡萄酒香氣的主體呈香物質或特征化合物[15-17]。每種揮發性組分的OAV是由該物質的含量除以其嗅覺閾值得到的，本研究中的嗅覺閾值及氣味描述均引自參考文獻[13]。

2 結果與討論

2.1 香氣物質組成

通過AMDIS技術對GCMS總離子流圖譜進行解析后在蛇龍珠和卡曼娜葡萄酒中共鑒定出116種揮發性物質，結果見表1。

表1 蛇龍珠與卡曼娜葡萄酒中香氣物質組成Table 1 Aroma compositions in Carménère red wines from China and Chile

續表

由表1可知，蛇龍珠中鑒定出113種物質，卡曼娜中111種。乙酸己酯、2，4-己二烯酸乙酯、7-辛烯酸乙酯、β-香葉烯和橙花醚僅在蛇龍珠中檢測而卡曼娜中未檢出，苯甲酸甲酯、糠酸甲酯和4-甲基愈創木酚僅在卡曼娜中檢測而蛇龍珠中未檢出。所有檢出的物質共包括14個類別，分別為C6醇、高級醇、乙酸酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸高級醇酯、有機酸、醛、酮、萜烯、降異戊二烯、呋喃、內酯、揮發性酚和甲氧基吡嗪。其中包含物質種類最多的為高級醇和脂肪酸乙酯，分別包括27種和25種物質。總含量最大的也是高級醇和脂肪酸乙酯兩類物質，在蛇龍珠中高級醇和脂肪酸乙酯的含量為揮發性物質總量的85.4%和13.6%，而在卡曼娜中這兩類物質的比例分別為94.7%和4.3%，在2種葡萄酒中這兩類物質的總量均達到了揮發性物質總量的99%。

蛇龍珠葡萄酒比卡曼娜含有更多的C6醇、脂肪酸乙酯、脂肪酸高級醇酯、有機酸、醛、降異戊二烯，而卡曼娜中的高級醇、乙酸酯、酮和萜烯的含量比蛇龍珠更高。此外，來源于橡木桶的呋喃和揮發性酚這兩類物質的總量在兩種葡萄酒中差異不大，同樣來源于橡木的兩種橡木內酯類物質則在蛇龍珠中含量較高，表明兩種葡萄酒在陳釀過程中同橡木的接觸時間或方式是有差異的。

2.1.1 C6醇和高級醇

C6醇類物質通常都具有植物或青草的氣味，常常會給葡萄酒的香氣帶來負面的影響[15]。在蛇龍珠和卡曼娜葡萄酒中共檢測出4種C6醇類物質，其中含量最大的為己醇。在蛇龍珠葡萄酒中，這4種C6醇的含量均比卡曼娜要高。

高級醇也常被稱為雜醇油，這些物質一般具有較為強烈的刺激氣味。這類物質是酵母酒精發酵的副產物，隨著其含量的不同會對酒的香氣產生或好或壞的影響。當其總量（不包括具有果香的2，3-丁二醇和具有花香的2-苯乙醇）較低時（＜300mg/L），可以增加葡萄酒香氣的復雜性，但在高濃度時（＞400mg/L）會使酒的香氣變得粗糙[18]。在蛇龍珠中，除2，3-丁二醇和2-苯乙醇以外的高級醇含量為412.33mg/L，而在卡曼娜中其含量為704.54mg/L，高級醇含量上的差異表明蛇龍珠的香氣品質可能更為細膩。

2.1.2 酯類物質

在葡萄酒中，酯類物質是僅次于高級醇的第二大類揮發性物質，也是酵母酒精發酵過程中產生的次生代謝物，這類物質物質對葡萄酒的果香有著重要的貢獻作用[19]。乙酸酯是由酵母氨基酸或糖代謝產生的高級醇和乙酰輔酶A反應形成，而脂肪酸乙酯則是由酵母脂肪酸代謝過程中產生的脂酰輔酶A醇解產生的[18]。同高級醇的差異趨勢一致，蛇龍珠葡萄酒中高級醇乙酸酯的含量僅為卡曼娜中的29%，其中具有香蕉味的乙酸異戊酯含量差異最大，這一物質在蛇龍珠中的含量不足卡曼娜中的1/3。而脂肪酸乙酯含量的差異則完全相反，這類物質中的大多數在蛇龍珠中的含量都高于卡曼娜，其中最明顯的幾種物質包括乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯和水楊酸乙酯。

此外，乙酸己酯、2，4-己二烯酸乙酯、7-辛烯酸乙酯均在蛇龍珠中檢測到了，而卡曼娜中沒有檢出。

2.1.3 脂肪酸

葡萄酒中的揮發性脂肪酸主要是由酵母和乳酸菌在脂肪酸代謝過程中產生的，這些物質一般都會呈現出脂肪、酸腐以及奶酪的氣味。當其含量低于閾值時，這些物質可以增加葡萄酒香氣的復雜性，但如果高于閾值則會給酒的香氣帶來負面影響[18]。蛇龍珠和卡曼娜葡萄酒中均檢測出了7種脂肪酸，其總量和各自組成比例在兩種葡萄酒中差異較小。丙酸和異丁酸的含量最大，其次是己酸，這3種酸的含量占脂肪酸總量的70%～80%。2種葡萄酒中差異最大的是丁酸，它在蛇龍珠中的含量是卡曼娜中的近兩倍。

2.1.4 醛、酮

2種葡萄酒中共檢測到10種羰基化合物（6種醛和4種酮），其中主要由蘋乳發酵過程產生的乙偶姻是最主要的羰基化合物，其次是雙乙酰。值得注意的是，蛇龍珠中的苯甲醛和苯乙酮的含量遠遠高于卡曼娜，這兩種物質在蛇龍珠中的含量分別是在卡曼娜中含量的7.3倍和5.6倍。

2.1.5 萜烯和降異戊二烯

雖然為非芳香品種，但通過解卷積技術仍然在蛇龍珠和卡曼娜葡萄酒中檢測出了12種萜烯類物質，其中蛇龍珠中檢出11種，卡曼娜中檢出10種。β-香葉烯和橙花醚僅在蛇龍珠中檢出，而卡曼娜中沒有檢出。從萜烯類物質的總量來看，卡曼娜略高于蛇龍珠，除橙花醇和反式-呋喃型氧化里那醇外，其他萜烯都在蛇龍珠中含量較高。

降異戊二烯類物質對葡萄酒的香氣有著重要的影響作用，因為這類物質的感官閾值普遍較低。2個樣品中均檢測到6種降異戊二烯類物質，但這些物質在兩個樣品中的含量差異較大。蛇龍珠中降異戊二烯的總量是卡曼娜的1.77倍，除超出檢測限未能定量的β-紫羅蘭酮外，其他5種物質在蛇龍珠中的含量均高于卡曼娜。

葡萄酒中的萜烯類物質和降異戊二烯類物質主要源于葡萄果實，由其前體物質在發酵和陳釀過程中逐漸釋放出來的，這些物質的組成和含量更多地反映了葡萄原料自身的特征，而受到工藝因素的影響相對較小[20]。蛇龍珠和卡曼娜這兩個由不同產地的同一葡萄品種釀造的葡萄酒在萜烯和降異戊二烯組成和含量上的差異，正反映了該品種在我國河西走廊和智利莫萊山谷這兩種生態條件下的不同表現。

2.1.6 呋喃、內酯和揮發性酚

葡萄酒中的呋喃、內酯和揮發性酚這三類物質主要是在橡木桶陳釀過程中（或與其他橡木輔料接觸）由橡木進入到葡萄酒中的。這些物質的組成差異主要反映了2種葡萄酒陳釀工藝的區別，尤其是陳釀用橡木桶的產地、烘烤程度和陳釀時間。從檢測出的這些物質含量可以看出，蛇龍珠和卡曼娜葡萄酒中僅橡木內酯含量存在著較大的差異，其中蛇龍珠中橡木內酯含量高于卡曼娜，這說明蛇龍珠在橡木桶中的陳釀時間可能更長[21]。此外，2種葡萄酒中順式和反式橡木比例也存在差異，說明陳釀用木桶的橡木品種或產地也是不同的[22]。

2.2 主要呈香物質鑒定

為了從眾多揮發性物質中找出對香氣貢獻較大的物質，本研究對2種葡萄酒中揮發性組分的香氣活性值（OAV）進行了計算，OAV＞1表明該物質含量超過了其閾值，對葡萄酒的香氣有所貢獻，OAV值越大表明其對香氣的影響越大。蛇龍珠和卡曼娜葡萄酒中主要呈香物質的OAV值及其閾值、氣味描述參考文獻[13]，結果見表2。

表2 蛇龍珠與卡曼娜葡萄酒中的主要呈香物質香氣值、閾值及氣味描述Table 2 OAV,threshold value and odor description of Carménère red wines from China and Chile

由表2可知，蛇龍珠和卡曼娜葡萄酒中主要的呈香物質（OAV＞0.1）共有42種，其中蛇龍珠41種、卡曼娜38種。β-大馬士酮、左旋-2，3-丁二醇、苯乙醛和己酸乙酯4種物質OAV在2種葡萄酒中均位于前四位（OAV均＞5.0），其OAV之和分別為OAV總和的57%（卡曼娜）和64%（蛇龍珠）。此外，在卡曼娜葡萄酒中，異丁醇的OAV也達到了6.41，僅次于上述4種物質。橡木內酯、乳酸乙酯和9-癸烯酸乙酯的含量在蛇龍珠中超過了其閾值，但在卡曼娜中均低于其閾值。具有典型香蕉香氣的乙酸異戊酯對卡曼娜香氣有較大貢獻（OAV=3.33），但在蛇龍珠中其含量低于其閾值。

尹建邦[12]曾利用OAV值對蛇龍珠葡萄酒特征香氣組分進行了鑒定，發現辛酸乙酯、己酸乙酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯、異戊酸和β-大馬士酮是蛇龍珠葡萄酒的主要呈香物質，這與本文的研究結果有所差異，除β-大馬士酮和己酸乙酯外，辛酸乙酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯和異戊酸在本文檢測的蛇龍珠和卡曼娜葡萄酒中其含量均低于閾值。產生這種差異的原因可能有三個方面：首先是某些物質所參考的閾值不同，二是所測樣品之間的差異，最后還有可能就是定量方法上的差異。

為了根據葡萄酒香氣物質的組成對其香氣輪廓進行模擬，參照其他相關研究[13，17]可以將各香氣物質按其氣味特征進行分組，將每一氣味特征類似的物質歸為一組，并計算該組的OAV總和，即可對樣品的香氣輪廓進行模擬。根據以檢測出香氣物質的氣味特征將其分為11個組，分別為：1=水果香，2=植物味，3=干果香，4=焦糖味，5=霉土味，6=化學味，7=脂肪味/奶油味，8=花香，9=烘烤味，10=橡木味，11=香料味。具體分組方式見表2，部分物質由于對不同類別香氣均有貢獻，因此可能同時列入某幾個組中。

圖1 蛇龍珠與卡曼娜葡萄酒的香氣輪廓圖Fig.1 Aroma profile of Carménère red wines from China and Chile

圖1為經上述方法獲得的蛇龍珠與卡曼娜葡萄酒的香氣輪廓圖，其中干果香、霉土味和烘烤味由于OAV總和＜1，因此未列入圖中。由圖1可知，水果香、焦糖味、花香和脂肪味（奶油味）為兩種葡萄酒的主要特征香氣，其次為化學味和植物味。2種葡萄酒的總體香氣輪廓較為相似，但也有所區別。蛇龍珠葡萄酒比卡曼娜具有更強的花香、焦糖味和橡木味，而化學味和植物味則略弱與后者。香氣輪廓模擬的結果同2種葡萄酒感官品嘗的結果基本相符，但植物味在兩種酒的感官品嘗中蛇龍珠高于卡曼娜，而模擬計算的結果卻恰恰相反。造成這種差異的原因可能是某種（或某些）具有植物味的物質未能鑒定出或未能準確定量，這尚需要進一步研究才能確定這些物質。

3 結論

本文利用解卷積（AMDIS）技術并結合標樣定性和保留指數定性在蛇龍珠和卡曼娜葡萄酒中鑒定出116種揮發性風味物質，并根據定量結果和各物質的感官閾值對每種物質的OAV值進行計算，尋找出兩種葡萄酒中的主要呈香物質并根據OAV值對這兩種葡萄酒的香氣輪廓進行了模擬計算。本文研究發現我國河西走廊的蛇龍珠葡萄酒和智利莫萊山谷的卡曼娜葡萄酒總體香氣輪廓較為相似，蛇龍珠的花香、焦糖味和橡木味相對較強。β-大馬士酮、左旋-2，3-丁二醇、苯乙醛和己酸乙酯4種物質OAV均大于5.0，是2種葡萄酒共同的主要呈香物質。就香氣物質組成而言，蛇龍珠中的C6醇類、脂肪酸乙酯、脂肪酸、醛、萜烯、降異戊二烯、和內酯類物質含量較高，而卡曼娜中的高級醇、乙酸酯和酮類物質含量較高。

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