一例高致病性藍耳病病毒、圓環病毒2型和副豬嗜血桿菌混合感染的診斷

蔣建國1 張顯浩2 劉好朋2 賀東生3*

（1廣西桂林市蔬菜研究所，廣西桂林 541004；2廣東大華農動物保健品股份有限公司，廣東新興 527400；3華南農業大學獸醫學院，廣東廣州 510642）

一例高致病性藍耳病病毒、圓環病毒2型和副豬嗜血桿菌混合感染的診斷

蔣建國1 張顯浩2 劉好朋2 賀東生3*

（1廣西桂林市蔬菜研究所，廣西桂林 541004；2廣東大華農動物保健品股份有限公司，廣東新興 527400；3華南農業大學獸醫學院，廣東廣州 510642）

目前，豬場疫病混合感染的現象普遍存在，給我國養豬業造成了巨大損失。2013年10月，廣西省某集約化豬場約6周齡豬群發生以高熱、皮膚發紺、呼吸困難、關節炎為主要特征的傳染病。根據發病情況、臨床癥狀、剖檢變化并結合實驗室診斷方法進行綜合診斷，最終結果顯示，導致該豬場大規模發病并死亡的主要病原包括高致病性豬藍耳病病毒、豬圓環病毒2型和副豬嗜血桿菌，是典型的混合感染導致大規模發病及死亡的案例。

高致病性豬藍耳病病毒；豬圓環病毒2型；副豬嗜血桿菌；混合感染

高致病性豬藍耳?。╤pPRRS）是由基因缺失變異的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬的新型傳染病，可造成母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸癥狀，具有發病快、死亡率高等特點[1,2]。豬圓環病毒病是由豬2型圓環病毒（PCV2）感染導致的豬的一種免疫抑制性疾病，主要引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征[3]、保育豬和育肥豬的呼吸道疾病[4]及肉芽腫性腸炎[5]，并可使懷孕母豬發生繁殖障礙[6]。副豬嗜血桿菌（Hps）是豬上呼吸道的一種常在菌，在豬體免疫力降低時，可能轉化為致病菌，引起以纖維素性多發性漿膜炎、關節炎、腦膜炎、高熱和高死亡率為特征的全身性疾病[7]。由于病原種類的日趨復雜及飼養管理不當，豬場疫病混合感染的情況普遍存在。hpPRRS和PCV2均是危害我國養豬業的重大疾病，hpPRRS可引發豬體高熱、母豬繁殖障礙和仔豬的嚴重呼吸癥狀，死亡率很高，并能使豬體免疫受到抑制；單獨的PCV2感染雖不致病，但亦可引發豬體免疫抑制；而Hps多發于豬體免疫力降低時，但這種并發或繼發感染卻使豬群臨床癥狀更加復雜，同時使死亡率大大提高。本研究以2013年10月廣西某規?；i場約6周齡的豬群出現高熱、皮膚發紺、呼吸困難、關節炎等癥狀為案例，進行臨床及實驗室綜合診斷。

1 臨床癥狀及剖檢病變

2013年10月，廣西省某集約化豬場6周齡左右的保育仔豬突然發病，短時間內發病豬只迅速擴增至200頭，發病率高達60%，并呈現繼續傳染態勢。發病初期，以高熱、咳嗽、皮紅、耳朵發紺、腹股溝淋巴結腫脹為主，幾天后仔豬出現呼吸困難，關節腫脹、跛行，皮下水腫。發病豬多數出現全身淋巴結腫大出血，胸腔纖維素性滲出，心包積液，個別剖檢病死豬有胸膜粘連現象；肺臟表面有纖維素性滲出物，肺部出血，間質性肺炎，個別肺心葉肉變；個別腹部腸系膜表面有纖維素性滲出；腎、脾臟腫大，表面有纖維素性滲出物；關節液增多，且質地黏稠。

2 實驗室診斷

2.1 材料及方法

細菌培養基購自廣州環凱公司產品；病毒DNA/RNA抽提試劑盒、細菌基因組DNA抽提試劑盒、RT-PCR一步法試劑盒和ExTaq DNA聚合酶購自TAKARA公司；高致病性豬藍耳病檢測試劑盒購自北京世紀元亨公司，所用各種引物均為本實驗室設計合成。

2.2 細菌檢測

無菌采集病豬心包液，并將心包液、關節液、肺臟接種于鮮血培養基、麥康凱培養基（MAC）、胰蛋白大豆瓊脂（TSA）培養基上，37℃溫箱中培養24～48小時。挑取單菌落涂片，進行革蘭氏染色和瑞氏染色鏡檢。挑取單菌落接種至液體培養基進行純化培養，利用細菌DNA抽提試劑盒提取分離培養物的總DNA，應用PCR方法檢測副豬嗜血桿菌。

2.3 病毒核酸檢測

選取具有典型病變特征的肺臟、淋巴結、扁桃體、脾臟等臟器進行研磨處理后，利用TAKARA MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒進行病毒DNA和RNA的抽提，采用PCR和RT-PCR方法對PCV2、hpPRRSV、PRSV、CSFV進行檢測。

3 結果

3.1 細菌檢測結果

經接種培養，在TSA培養基上長出一些小而透明的菌落，其余培養基無菌落生長。染色鏡檢顯示，生長菌為革蘭氏陰性的小桿菌，瑞氏染色兩極濃染。細菌分離純化后，抽提DNA進行副豬嗜血桿菌PCR檢測，結果顯示，被檢樣品在相應位置出現620 bp的陽性擴增條帶（圖1a），與預期片段大小相符，說明分離細菌為副豬嗜血桿菌。

3.2 病毒核酸檢測結果

分別以提取的病毒DNA或RNA及PCV2、PRV、hpPRRSV、CSFV特異性檢測引物或試劑盒進行PCR或RT-PCR反應。結果顯示：PCV2引物的PCR擴增出773 bp的陽性條帶，hpPRRSV試劑盒的RT-PCR擴增出272 bp的陽性條帶，均與預期片段大小相符；而PRV、CSFV檢測無陽性條帶出現，為陰性（圖1）。

圖1 PCR/RT-PCR的實驗室檢測結果

4 討論

分子生物學診斷技術的應用為疫病的快速確診提供了捷徑，尤其是PCR方法的應用，已經成為現今最簡單、最便捷的分子生物學診斷方法。本次疫情就是在結合發病情況、臨床癥狀、剖檢病變的基礎上，根據實驗室PCR診斷結果，確診本次廣西省某集約化豬場發生的疫情為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒2型和副豬嗜血桿菌的混合感染。

近年來，由于多種原因，集約化豬場各種混合感染的疫情屢見不鮮，且多以各種形式存在，以PRRSV、PCV2、PRV、CSFV混合感染為主，給臨床病原學的確診和防治增加了一定難度，并影響了我國現代養豬業的健康快速發展。尤其2006年高致病性豬藍耳病暴發以來，該病給我國養豬業造成了重大損失，由此引起的豬群免疫力低下、免疫抑制，極易造成豬群的混合感染和繼發感染。

目前，對混合感染疫病只能通過合理的免疫程序、采取一定的綜合防治措施、強化衛生消毒、加強飼養管理、嚴格控制引種和“全進全出”來防控；同時定期進行免疫抗體水平監測，提高免疫效果和豬群對疫病的抵抗力。

[1]陳瑞愛,裴仉福,羅滿林.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的免疫效果觀察[J].中國動物保健,2009(7):83-86.

[2]劉永宏,趙麗,劉俊峰,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒BJBLZ株序列剖析[J].生物技術通訊,2011(10):185-190.

[3]朗洪武,程君生,張廣川.豬斷奶后多系統衰竭綜合征[J].中國獸醫雜志,2000(1):39-42.

[4]Cheng CC,Lee YF,Lin NN,et al.Bronchiolitis obliterans organizing pneumonia in swine associated with porcine circovirus type2infection[J].JBiomedBiotechnol2011.doi: 10.1155/2011/245728.

[5]Kim J,Ha Y,Jung K,et al.Enteritis associated with porcine circovirus 2 in pigs[J].Can J Vet Res,2004(68):218-221.

[6]Chae C.A review of porcine circovirus 2-associated syndromes and diseases[J].Vet J.2005,169(3):326-336.

[7]趙德明,張仲秋,沈建忠,譯.豬病學[M].第九版.北京:中國農業大學出版社,2009:769-782.

S858.28

B

1673-4645(2014)10-0051-03

2014-05-19

廣東省農業科技重大技術研究項目(粵財農[2013]185號)

*通訊作者:賀東生，博士，研究方向為獸醫傳染病