維藥PCR技術探析

靳 劍，張 新

(1. 烏魯木齊市中醫醫院 藥學部，新疆 烏魯木齊 830000；2.烏魯木齊市燒傷醫院 藥劑科，新疆 烏魯木齊 830000)

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維藥PCR技術探析

靳 劍1，張 新2

(1. 烏魯木齊市中醫醫院 藥學部，新疆 烏魯木齊 830000；2.烏魯木齊市燒傷醫院 藥劑科，新疆 烏魯木齊 830000)

目的：根據PCR聚合酶鏈反應，采用分子生物技術探析維藥在PCR方面的技術應用。方法：采用高溫低pH法，防止組織被破壞及其它物質的氧化，提取高純度DNA，直接用于隨機擴增多態性DNA(PADA)等分子水平遺傳標記PCR 擴增反應。結果：大部分維藥可獲得總的DNA提取，無擴增產物出現。結論：PCR技術鑒定維藥具有快速、簡捷、方便、有效的特點。

維藥；高溫低pH；PCR

PCR為聚合酶鏈反應，原理為通過利用分子生物引物，將原痕跡量DNA擴增到足以進行檢測與分析的數量，具有高速、高效、優質和全部自動化的優點[1-3]。隨著科學技術的不斷深化和發展，制定新的快速、有效、簡捷、專屬性強的現代化檢測方法勢在必行。維藥作為民族醫藥有著舉足輕重的地位，目前維藥還沒有比較規范的整套鑒定方法[4]。PCR擴增的模板DNA作為遺傳信息載體，不受外界因素、生物發育階段及器官組織差異等影響，具有高速、高效和高特異性等特點[5]。從分子生物學的角度檢測藥品更能確保其質量可靠，現簡單探析維藥的PCR技術工藝,具體報道如下。

1 材料與試劑

1.1 維藥種類

1.1.1 菊科 5種菊科維藥的名稱、來源、拉丁名見表1。

表1 5種菊科維藥

1.1.2 豆科 10種豆科維藥的名稱、來源、拉丁名見表2。

1.1.3 傘形科 9種傘形科維藥的名稱、來源、拉丁名見表3。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 低溫高速離心機(上海醫用分析儀器廠)，恒溫水浴箱，恒溫搖床，冰箱，電子天平，DYCP-31B型電泳，PCR儀(MJ Research PTC-100TM，Programmable Thermal ,USA)，DYY-穩壓電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像儀。

表2 10種豆科維藥

1.2.2 試劑 SDS(十二烷基硫酸鈉)，EDTA(乙二胺四乙酸)，β-硫基乙醇，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，氯仿，醋酸鈉，醋酸鉀，異戊醇，異丙醇，瓊脂糖，1×TBE溶液，溴乙錠，二甲基苯青，其它溶劑均為國產分析純。

1.4 植物藥前處理

1.4.1 高溫低pH法 該法提取的藥品DNA純度較高，主要原理為：利用低pH提取介質，可有效防止組織被破壞、材料沉淀時的電離作用及酚化物氧化。所提取DNA純度較高，無需進一步純化，可直接用于隨機擴增多態性DNA(RADP)等分子水平標記。采用低pH介質高鹽沉淀蛋白方法，可從新鮮材料或干品植物材料中提取得到總DNA。

表3 9種傘形科維藥

1.4.2 方法 市售干品藥材粉碎，過60目篩，采用去離子水清洗，紫外線照射30min，取粉末0.3g,置研缽中，加1.0g玻璃沙研磨至極細粉末。加入預熱(50℃)的緩沖液A(100mmol·L-1醋酸鈉，50mmol·L-1EDTA,500mmol·L-1NaCl,2.5%PVP，3%SDS,1%β-巰基乙醇，pH為5.5)于研缽中混勻，取10mL于離心管中，置恒溫床(56℃)溫育30min，于轉速10 000r/min離心10min。取上清液至另一離心管中，加2/3倍體積2.5M(pH為4.8)醋酸鉀洗液置于4℃冰箱保存30min，于轉速10 000r/min離心10min；轉移上清液移至另一離心管中，加等體積氯仿-異戊醇混勻，4℃、10 000r/min離心15min重復1次；上清液加2/3體積冷異戊醇(-20℃)混勻置-20℃冰箱30min。于4℃、10 000r/min離心20min，吸取上清液采用70%乙醇沉淀2次，洗去乙醇，倒置試管于吸水紙上，于無菌臺吹風機吹干，加入ET洗液300～400μL,4℃保存備用。

2 結果

2.1 DNA檢測

檢測已提取的植物總DNA，采用瓊脂糖電泳方法：置于1%的瓊脂凝膠，加示蹤劑(溴酚藍和二甲基苯青)電泳30min，完畢，凝膠成像儀中觀察。

2.2 PCR擴增反應

反應總體積為 30μL，成分：2×TBE緩沖液15μL，牛血清蛋白(BSA)1.5μL，2個引物各2μL,ddH2O 9.5μL，模板DNA(植物基因DNA)2μL。程序：94℃變性，36℃退火35s，72℃延伸70s，2個循環，94℃變性，36℃退火35s，72℃延伸70s，42個循環共44個循環[1]；94℃預變性，180s；94℃，60s；39℃，45s；72℃，60s；35個循環最后72℃，180s。

取上述反應液10μL檢測，置1.6%的瓊脂糖凝膠上，加示蹤染料，采用10×TBE的電極緩沖液30min，完畢，在凝膠成像儀中成像。

2.3 無產物出現原因

循環溫度、解鏈溫度不夠確切，或者PCR儀指示溫度與實際溫度不符；引物組成不合理；聚合酶活性發生異常；植物來源DNA較難去除多糖、多酶等物質，可能抑制PCR反應。

3 討論

本實驗所用維藥均為維吾爾醫院所提供的干品藥材，大都能提取總DNA，說明PCR技術具有應用廣泛的特點；對提取出來的二十三味藥進行PCR 擴增反應，無擴增譜帶出現，可看見引物聚合點。提示PCR技術在種類與質量方面的研究，可為維藥提供更快、更簡捷、更有效的鑒定方法[6]。

本實驗準備較為充分，但是由于受實驗條件的限制，致使實驗結果并不理想。藥材總DNA提取較好，但在DNA片段擴增時，引物的選用尚處于初步摸索階段，同時由于時間有限，致使最終的結果并不理想。多次實驗僅能看到引物聚合點，而無擴增片段出現。因此，實驗方法、引物的選用及擴增程序還需進一步摸索與改進。

[1] 王培訓,周聯,賴小平.分子生物學技術與中藥鑒[M].廣州：廣東世界圖書出版公司,2002： 92-112.

[2] 劉勇民,沙吾提·伊克木.維吾爾藥志[M].烏魯木齊：新疆人民出版社,1985.

[3] 肖樹雄,林偉忠.中藥現代檢驗新技術[M].廣州：羊城晚報出版社，2003：137-183.

[4] 中藥大辭典編寫組.中藥大辭典(上、下冊)[M].上海：上海科學技術出版社，1975.

[5] 吳平,周亞平.用聚合酶鏈產物直接測序技術鑒定中藥鱉甲[J].中國藥科大學學報, 1982,29(1)：17-21.

[6] 徐朝暉,涂為,楊松松.RAPDF法結合TLC鑒別中藥牛蒡子及其混淆品[J].中草藥,2000，3(6)：45-46.

(責任編輯：李嵐春)

2014-04-29

靳劍(1982-)，男，烏魯木齊市中醫醫院藥學部藥師，研究方向為維藥現代化研究。

R291.5

A

1673-2197(2014)16-0014-02