三七總皂苷對血脂異常患者內皮祖細胞數量的影響

鄺穎頤，黃經光，彭榮珍，盧俊嫻，陳文靜，蘇雪芳

(1.暨南大學醫學院第六附屬醫院，廣東 江門 529000；2.江門中醫藥學校，廣東 江門 529000)

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三七總皂苷對血脂異常患者內皮祖細胞數量的影響

鄺穎頤1*，黃經光1，彭榮珍2，盧俊嫻1，陳文靜1，蘇雪芳1

(1.暨南大學醫學院第六附屬醫院，廣東 江門 529000；2.江門中醫藥學校，廣東 江門 529000)

目的：觀察三七總皂苷對血脂異常患者內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)數量的影響。方法：將64例血脂異常患者隨機分為治療組與對照組各32例，對照組采取常規治療，治療組在對照組基礎上加用血栓通注射液治療，療程為10天。療程結束后抽取患者外周全血20mL進行EPCs培養，運用貼壁選擇法，采用流式細胞術觀察三七總皂苷對EPCs數量的影響。 結果：三七總皂苷能提高血脂異常患者外周全血EPCs數量，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。 結論：三七總皂苷可顯著改善血脂異常患者EPCs的數量，并通過該途徑保護心腦血管。

血栓通注射液；血脂異常；內皮祖細胞

血脂異常是導致冠心病、腦血管意外、動脈粥樣硬化等重要危險因素。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是指特異性歸巢于血管新生、血管損傷部位，機體中存在可分化成內皮細胞的干/祖細胞，該細胞具有防治血管成形術后再狹窄、預防早期動脈粥樣硬化、修復體內血管內膜的損傷等作用。相關研究[1]報道，血脂異常患者外周血中內皮祖細胞出現功能受損，且數量減少。因此，研究有效藥物增加外周血功能EPCs數量，成為防治冠心病、腦血管意外、動脈粥樣硬化等疾病的重要方法。血栓通注射液是由中藥三七經提取精制的中成藥注射液，主要成分為三七總皂苷。據研究[2]表明，三七總皂苷具有改善腦循環、防治心肌缺血再灌注損傷、抗血栓、抗動脈粥樣硬化及降脂肪等作用，但目前研究僅局限于動物整體水平和離體器官等研究，尚未深入到分子、細胞水平，缺乏循證醫學支持。觀察血栓通注射液對血脂異常患者內皮祖細胞功能和數量的影響，從細胞水平進一步明確血栓通注射液的作用機制。

1 資料與方法

1.1 納入標準

血脂異常患者診斷標準參照2007年中國成人血脂異常防治指南制定聯合委員會制定的《中國成人血脂異常防治指南》。[3]

1.2 排除標準

不符合納入標準者；伴有嚴重并發癥；合并患有嚴重循環系統、呼吸系統、消化系統等疾病；合并有惡性腫瘤、感染、外科手術、視網膜病變、外傷等影響內皮祖細胞疾病；藥物過敏及過敏體質者；依從性差，不配合治療者。

1.3 一般資料

選取2012年1月—2014年1月我院收治的64例血脂異常患者作為研究對象，按住院時間隨機分為治療組與對照組各32例。其中治療組男18例，女14例，年齡41～71歲，平均年齡(55±9)歲，病程11個月至3年；對照組男15例，女17例，年齡42～69歲，平均年齡(53±7)歲，病程1～4年。兩組患者的性別、年齡、病程等資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.4 方法

1.4.1 藥物與材料 血栓通注射液(0.25g，廣西梧州制藥(集團)股份有限公司，批號13110714)，DiI-ac-LDL(Molecular probe公司)，PBS、Hanks液、ECSG、M199、胰酶、胎牛血清(均購自GIBCO公司)，FITC-AC133及PE-VEGFR-2(Bender systemTM)，PE-CD34(Caltag Laboratories)，MTT(華美生物工程公司)，VIII因子免疫組化相關抗原試劑盒(武漢博士德生物工程公司)，VEGF(Peprotech EC公司)，纖維連接蛋白(Roche公司)。

1.4.2 治療方法 對照組予以常規治療，治療組在對照組基礎上給予血栓通注射液450mg，溶于5%葡萄糖注射液或0.9%生理鹽水靜脈滴注，1次/d，療程為10天。療程結束分別抽取兩組患者空腹全血20mL，對血中EPCs進行培養并分析。

1.4.3 EPCs培養 纖維連接蛋白預先包被24孔培養皿，取全血20mL分離單個核細胞。方法：采用密度梯度離心法，以5×106個/mL種于培養皿，將1mL含鏈霉素(100U/mL)、青霉素(100U/mL)及胎牛血清(20%)的M199加入每個培養皿，置培養箱中培養，培養環境為飽和濕度、5%CO2和37℃。3天后添加培養液，洗去未貼壁細胞，繼續培養待用[4]。

1.4.4 EPCs鑒定 吸取0.25%的胰酶適量消化培養后的EPCs，并制成單個細胞懸液(1×106個/mL)，加入10μL(1mg/mL)熒光標記的AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin或CD34，采用流式細胞儀分析細胞中AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin、CD34的表達水平。以2.4μg/mL終濃度加入培養皿DiI-ac-LDL避光與細胞孵育4h，熒光顯微鏡下觀察洗去培養液后的細胞熒光指標；以同批培養細胞作為空白對照組，但不加DiI-ac-LDL，驗證培養細胞吞噬DiI-ac-LDL能力，采用GSC7901(胃癌細胞株)予陰性對照。檢測免疫組化法培養細胞Ⅷ因子相關抗原的，采用GSC7901予陰性對照[5]。

1.4.5 EPCs數量檢測

取各組1/10分離的單個核細胞，制成單個細胞懸液(1×106個/mL)，加入熒光標記的AC133、CD34各10μL(1mg/mL)，通過流式細胞儀分析細胞AC133、CD34的表達，運用Quest軟件分析計算雙陽性細胞。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 EPCs鑒定

洗去碎片及未貼壁細胞，培養3天后，可見典型細胞集落：向外擴散，外周為紡錘形細胞，層層疊疊；中間為大量圓形細胞，略高于培養平面，呈白色半透明，見圖1。流式細胞儀分析顯示6天后細胞AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin和CD34表達。熒光顯微鏡檢：多數細胞隨培養時間延長可吞噬DiI-ac-LDL，激發灰色熒光，見圖2；陰性對照和空白對照均無熒光。免疫組化示培養2天后Ⅷ因子相關抗原為陽性，呈棕色胞漿，陰性對照和空白對照均不顯棕色。

圖1 細胞集落(×100)

圖2 細胞吞噬DiI-ac-LDL(×200)

2.2 血栓通注射液對全血EPCs數量的影響

與對照組相比，血栓通注射液能夠增加EPCs數量，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 血栓通注射液對全血EPCs數量的影響 個/mL)

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

血脂異常患者血清中ox-LDL過高可誘導內皮細胞的氧化損傷甚至凋亡，從而導致內皮功能障礙。因此血脂異常為冠心病、腦血管意外、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的重要致病因素。相關研究報道[6]，損傷內皮的再內皮化可有效減少新內膜厚度和平滑肌細胞增殖，而再內皮化過程需EPCs的參與。

EPCs作為內皮細胞的同一譜系，其功能和數量同樣受到血脂異常的影響，主要作用機制為：ox-LDL影響EPCs的動員及分化；ox-LDL參與EPCs的凋亡過程；ox-LDL直接損傷EPCs。提示通過治療手段提高血脂異常患者外周血中EPCs數量，能有效降低血脂異常患者發生冠心病、腦血管意外、動脈粥樣硬化等并發癥概率。

血栓通注射液為傳統中藥材三七經提取工藝精制而成的中成藥注射液，主要成分為三七總皂苷。現代藥理研究表明血栓通注射液作用機制可能通過減少骨髓基質細胞RANKL表達，增加OPG表達[7]。實驗研究證明，三七總皂苷可顯著提高血脂異常患者外周血中EPCs數量，從細胞水平上為三七總皂苷作用心腦血管途徑提供了新的理論依據，具有極大意義。

[1] 季亢挺，張懷勤，李海鷹，等.高膽固醇血癥患者外周血內皮細胞的變化及丹參的保護作用[J].中華中醫藥學刊,2007,25(6):1173-1175.

[2] 陳劍梅，郭潔文.三七總皂苷對心腦血管作用的藥理研究新進展[J].今日藥學,2011,21(7):389-392.

[3] 中國成人血脂異常防治指南制訂聯合委員會.中國成人血脂異常防治指南[J].中華心血管病雜志,2007,35(5):390-419.

[4] 季亢挺，張懷勤，唐積肥，等，丹參對高膽固醇血癥患者內皮祖細胞數量及功能的影響[J].中國中藥雜志,2007,32(12):1214-1217.

[5] WERNER N, JUNK S, LAUFS U, et al. Intravenous transfusion of endothelial progenitor cells reduces neointima formation after vascular injury[J]. Circulation Res,2003,93(2):e17.

[6] GRIESE D P, EHSAN A, MELO L G, et al.Isolation and transplan-tation of autologous crculating endothelial cells into denuded vessels and prosthetic grafts：implications for cell-based vascular therapy[J]. Circulation,2003,108(21):2710.

[7] 王云國，劉東昕，王虎，等.三七總皂甙對大鼠骨髓基質細胞OPG/RANKL表達比的影響[J].今日藥學,2012,22(8):456-459.

(責任編輯：李嵐春)

2014-05-08

鄺穎頤，女，廣東省江門市暨南大學醫學院第六附屬醫院主管藥師，研究方向為臨床藥學。

R589.2

A

1673-2197(2014)16-0090-02