丙酮酸鹽對阿爾茨海默病大鼠學習記憶的影響☆

王曉楠胡雪君楊旸王斯琪

丙酮酸鹽對阿爾茨海默病大鼠學習記憶的影響☆

王曉楠*胡雪君*楊旸*王斯琪*

目的研究丙酮酸鹽對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)模型大鼠學習記憶的影響并探討其與海馬神經細胞死亡的關系。方法將36只wistar大鼠隨機分為空白對照組、AD模型組和丙酮酸鹽治療組，根據實驗要求給藥處理6周，同時觀察各組大鼠一般情況，Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力，蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin,HE）染色檢測海馬神經細胞死亡，利用 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA)來檢測海馬CA1區內活性氧（reactive oxygen species,ROS）聚集情況。結果丙酮酸鹽治療組與AD模型組比較，一般情況均明顯改善，逃避潛伏期均明顯縮短(41.37±6.24,31.67±7.26,24.26±7.16,20.45±5.72, 19.36±5.89,均P＜0.05)；原平臺象限活動時間明顯增加(50.36±7.46 s,P＜0.05)，穿越原平臺次數明顯增多(3.98± 1.23次/2 min，P＜0.05)，海馬CA1區錐體神經細胞死亡顯著減少(P＜0.05)，海馬神經細胞內ROS的水平也顯著降低（P＜0.05）。結論丙酮酸鹽可能通過降低海馬組織內ROS的產生，減少海馬神經細胞死亡，從而提高AD模型大鼠的學習記憶水平。

丙酮酸鹽 阿爾茨海默病 學習記憶

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種神經退行性疾病，以進行性記憶減退和認知功能障礙為主要臨床癥狀，但AD的病因和發病機制復雜,目前AD的確切病因尚不清楚,許多病理過程參與其中,神經細胞外β-淀粉樣蛋白(β-amy?loid，Aβ)沉積是AD的主要神經病理學特征之一[1]。可溶性Aβ寡聚體是導致神經元功能紊亂并最終導致AD記憶損傷的上游因素，其神經毒性的作用機制尚不明確，研究表明主要與Ca2+紊亂和氧化應激(活性氧ROS的產生)等密切相關[2-3]。丙酮酸鹽可作為細胞保護劑，改善嚴重低血糖所致的神經細胞死亡和認知功能障礙[4-5],保護神經細胞拮抗β-淀粉樣蛋白所致的神經細胞死亡[6]。為此，我們觀測丙酮酸鹽對AD大鼠模型認知功能和海馬神經細胞的影響，旨在為AD的防治提供新的思路及有益的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性Wistar大鼠，體重200～250 g，清潔級，由中國醫科大學實驗動物中心提供，適應性飼養1周后，經Morris水迷宮測試36只反應正常的大鼠，隨機分為對照組（control）、AD模型組（AD）、和丙酮酸鹽治療組（AD+Py），每組l2只。

1.2 AD模型大鼠及用藥方法除對照組外，將實驗動物以3.6%水合氯醛腹腔注射（1 mL/100 g體重），麻醉后固定于腦立體定向儀上，按腦立體定位儀圖譜，于AP-3.0 mm，ML±2.0 mm，DV4.0 mm，即為海馬定位點，以微量注射器自腦表面垂直進針，在5 min內將1 μL Aβ1-42寡聚體（4 μg/μL）緩慢注入，留針5 min，緩慢退針，牙托粉填補針孔。所有操作均在無菌下進行，皮膚切開處用青霉素抗菌，縫合傷口。將大鼠放回籠中，單籠飼養至大鼠完全清醒，自由活動進食[7]。對照組在相同立體定位條件下，注射等體積PBS。術后1 d大鼠完全清醒，能自由活動進食后，丙酮酸鹽治療組給予干預治療，每天腹膜注射丙酮酸鈉500 mg/kg，對照組及AD模型組腹膜注射等滲NaCL注射液（104.5 mg/ kg），連續注射6周。在術后1周進行Morris水迷宮實驗,以對照組大鼠逃避潛伏期均值的95%上限值為標準,將超出上限值者確定為癡呆大鼠[8]。

1.3 Morris水迷宮實驗藥物干預6周后，將每只大鼠頭頸部毛發用普通染發劑涂黑，進行定位航行；測試時實驗室溫度在24～25℃，水迷宮中加入奶粉1 kg，用熱水沖開，再用水加至高過安全平臺1cm，水溫保持現在22℃，左右。末次給藥1 d后，采用Morris水迷宮定位航行和空間探索實驗測定大鼠間學習記憶能力。其中定位航行試驗歷時5 d，每天4次，每次間隔20 min。第五天進行空間探索實驗（即除去安全平臺觀察大鼠2分鐘內在平臺象限的游泳路程與總路程之比）。每次均3組平行進行。

1.4 海馬神經細胞死亡的測定各組實驗大鼠在最后一次進行Morris水迷宮測試后，各組分別取6只大鼠，常規灌注取材，制作石蠟切片，根據大鼠腦立位定位圖譜選海馬區附近連續切片12張，片厚4 μm，切片用PBS液漂洗2次，每次5 min，加入經蘇木精染色15～30 min，用水沖洗3 h，然后加入伊紅染色5 min，用乙醇分色。常規脫水、透明、封片，光鏡下觀察海馬神經細胞形態變化。

1.5 海馬神經細胞內活性氧（reactive oxygen spe?cies，ROS)聚集的測定各組實驗大鼠在最后一次進行Morris水迷宮測試后，各組分別取6只大鼠，取出完整海馬組織，利用2′,7′-dichlorodihy?drofluorescein diacetate (H2DCF-DA, Invitrogen, USA)來檢測海馬CA1區內ROS聚集情況[6]。

1.6 統計學方法采用SPSS17.0進行統計學處理，計量資料以表示，組間差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Scheffe法，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 一般情況兩周內各組無明顯差異，但之后AD模型組大鼠逐漸出現行動和反應遲緩，飲食減少，體質量下降，并進行性加重；而丙酮酸鹽治療組上述情況均有改善。

2.2 Morris水迷宮檢測如表1及表2所示，各組大鼠平均逃避潛伏期均日漸縮短，AD模型組與對照組比較逃避潛伏期明顯延長(P＜0.05)，原平臺象限活動時間明顯減少(P＜0.05)，穿越原平臺次數明顯減少(P＜0.05)。丙酮酸鹽治療組與AD模型組比較：逃避潛伏期均明顯縮短(P＜0.05)，原平臺象限活動時間明顯增加(P＜0.05)，穿越原平臺次數明顯增多(P＜0.05)。

表1 各組大鼠定向航行實驗中每日平均逃避潛伏期(，s)

表1 各組大鼠定向航行實驗中每日平均逃避潛伏期(，s)

1）與對照組比較P＜0.05；2）與AD組比較P＜0.05

2.3 蘇木精-伊紅染色如圖1所示，對照組大鼠海馬CA1區錐體神經元形態正常；AD模型組大鼠CA1區錐體神經元排列紊亂，神經元腫脹或皺縮，染色質聚集，白質區組織疏松，有膠質細胞增生現象；丙酮酸鹽治療組大鼠海馬CA1區錐體神經元形態正常。

2.4 海馬神經細胞內ROS的聚集情況如圖2所示，與對照組相比較AD模型組大鼠海馬神經細胞內ROS的水平明顯增高（P＜0.05），而丙酮酸鹽治療組大鼠海馬神經細胞內ROS的水平未見明顯變化（P＞0.05）。與AD模型組相比較，丙酮酸鹽治療組大鼠海馬神經細胞內ROS的水平明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

AD是一種神經退行性疾病，以進行性記憶減退和認知功能障礙為主要臨床癥狀，但AD的病因和發病機制復雜,目前AD的確切病因尚不清楚,許多病理過程參與其中,神經細胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積是AD的主要神經病理學特征之一[1]。AD的發病機制研究,近十年的主導假說是Aβ毒性學說,尤其是可溶性Aβ寡聚體的神經毒性作用日益被重視[9-11]。可溶性Aβ寡聚體的神經毒性遠強于其他不可溶性類淀粉樣蛋白，AD病情嚴重程度和突觸缺失程度與Aβ總量相關，但非線性關系，而與可溶性Aβ寡聚體呈線性相關。本研究利用Aβ1-42寡聚體海馬內注射制作AD大鼠模型。Aβ寡聚體是導致神經元功能紊亂并最終導致AD記憶損傷的上游因素，其神經毒性的作用機制尚不明確，研究表明主要與Ca2+紊亂和氧化應激(活性氧ROS的產生)等密切相關[3,12]。隨著對Aβ寡聚體在AD形成和發展中的認識和研究的不斷深入，靶向Aβ寡聚體的治療策略將成為AD治療中的重要途徑之一，有望很快進入臨床應用。與以往治療策略不同，Aβ寡聚體靶向治療不僅改善AD早期癥狀，而且可能減緩或減輕癥狀的惡化程度。

表2 各組大鼠空間探索試驗中原平臺象限活動時間和穿越原平臺次數

圖1 各組大鼠海馬組織CA1區的HE染色（400×）

圖2 各組大鼠海馬神經細胞內ROS的聚集情況 *與對照組比較P＜0.05；△與AD組比較P＜0.05

外源性的丙酮酸鹽（pyruvate）在體內轉化為丙酮酸根陰離子和（或）丙酮酸起作用。丙酮酸是體內糖酵解的中間產物，位于無氧酵解和有氧氧化代謝交接處，屬α-酮酸，是三大營養物質代謝的樞紐，其分子量小，可通過血腦屏障，經單羧酸轉運體自由進出細胞和線粒體，為丙酮酸鹽在體內作用提供保障。丙酮酸鹽不僅可作為三羧酸循環的底物產生腺苷三磷酸（ATP）為組織正常生理結構功能的維持提供能量，還可作為細胞保護劑，保護神經細胞拮抗谷氨酸鹽所致的神經毒性作用[13]并抑制鼠體內氧自由基的氧化作用[14]。丙酮酸鹽主要通過兩種機制起到抗氧化作用：其一，可直接通過非酶促的去碳酸基反應抑制過氧化氫；其二，補充丙酮酸鹽，可增強檸檬酸循環，檸檬酸產生增多后，抑制磷酸果糖激酶，從而進入磷酸戊糖旁路，產生還原型輔酶II（NADPH），從而間接地增加谷胱甘肽（GSH）抗氧化能力。丙酮酸鹽還可增加輔酶I/還原型輔酶I（NAD+/NADH）的比值，促進三羧酸循環反應。

本研究發現AD模型組逃避潛伏期明顯延長，原平臺象限活動時間和穿越原平臺次數明顯減少，且大鼠海馬組織內ROS的產生及CA1區錐體細胞的死亡顯著升高。同時發現丙酮酸鹽預處理實驗組一般情況較AD模型組明顯改善，逃避潛伏期明顯縮短，原平臺象限活動時間和穿越原平臺次數明顯增加，大鼠海馬組織內ROS的產生及CA1區錐體細胞的死亡顯著減少，說明丙酮酸鹽有效地改善了AD模型大鼠的學習記憶水平。由此我們推測丙酮酸鹽一方面可能通過逆轉Aβ寡聚體介導的Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）自動磷酸化水平的抑制來阻止Aβ寡聚體誘導的長時程增強（LTP）抑制，從而改善學習和記憶的損害；另一方面可能通過維持細胞內ATP水平及NAD+水平來拮抗Aβ寡聚體誘導的海馬神經細胞死亡，從而延緩AD進展；丙酮酸鹽的抗氧化作用可能是丙酮酸鹽神經保護作用的上游機制，但這一假說有待進一步研究證實。

[1]Selkoe DJ.The molecular pathology of Alzheimer′s disease[J].Neuron,1991,6(4):487-498.

[2]Nimmrich V,Grimm C,Draguhn A,et al.Amyloid beta oligo?mers(A beta1-42globulomer)suppress spontaneous synaptic ac?tivity by inhibition of P/Q-type calcium currents[J].J Neurosci, 2008,28(4):788-797.

[3]Florent S,Malaplate-Armand C,Youssef I,et al.Docosahexae?noic acid prevents neuronal apoptosis induced by soluble amy?loid-beta oligomers[J].J Neurochem,2006,96(2):385-395.

[4]Suh SW,Aoyama K,Matsumori Y,et al.Pyruvate administered after severe hypoglycemia reduces neuronal death and cognitive impairment[J].Diabetes,2005,54(5):1452-1458.

[5]Wang XN,Song XZ,Takata T,et al.Amyloid-β neurotoxicity restricts glucose window for neuronal survival in rat hippocam?pal slice cultures[J].Expe Gerontol,2010,45(11):904-908.

[6]Wang X,Takata T,Bai X,et al.Pyruvate prevents the inhibi?tion of the long-term potentiation induced by amyloid-β through protein phosphatase 2A inactivation[J].J Alzheimers Dis,2012,30(3):665-673.

[7]Hu S,Begum AN,Jones MR,et al.GSK3 inhibitors show bene?fits in an Alzheimer's disease(AD)model of neurodegeneration but adverse effects in control animals[J].Neurobiol Dis,2009, 33(2):193-206.

[8]黃濤波，呂誠，胡小令，等.雷公藤內酯醇對AD模型大鼠海馬神經細胞凋亡的影響［J］.中國老年學雜志，2010,30（19）：2766-2770.

[9]Kayed R,Head E,Thompson JL.Common structure of soluble amyliod oligomers implies common mechanism of pathogenesis [J].Science,2003,300(5618):486-489.

[10]R?nicke R,Mikhaylova M,R?nick S,et al.Early neuronal dys?function by amyloid β oligomers depends on activation of NR2B-containing NMDA receptors[J].Neurobiol Aging,2011, 32(12):2219-2228.

[11]黃書才，諶紅獻.ω-3多不飽和脂肪酸對認知功能影響的研究進展［J］.中國神經精神疾病雜志，2013，39（2）：111-114.

[12]段冉冉，李燕飛，賈延劼.與阿爾茨海默病發病機制相關的microRNA的研究進展［J］.中國神經精神疾病雜志，2013，39（9）：569-573.

[13]Miao Y,Qiu Y,Lin Y,et al.Protection by pyruvate against glu?tamate neurotoxicity is mediated by astrocyes through a glutathi?one-dependent mechanism[J].Mol Biol Rep,2011,38(5): 3235-3242.

[14]Varma SD,Heyde K,Henein M,et al.Oxidative damage to mouse lens in culture[J].Protective effect of pyruvate.Biochem Biophy Acta,2003,1621(3):154-155.

Effects of pyruvate on learning and memory in a rat model of Alzheimer’s disease.

WANG Xiaonan,HU Xue?jun,YANG Yang,WANG Siqi.

Departments of Respiratory and Infectious disease,the First affiliated Hospital of China Med?ical University,Shengyang,110001,China.Tel:024-83283770.

ObjectiveTo study the effects of pyruvate on learning,memory and neuronal cell death of the hippo?campus in a rat model of Alzheimer’s disease(AD).MethodsA total of 36 rats were randomly divided into control group,AD model group，and pyruvate group.General condition was observed after 6-week dipsacus treatment．Morris water maze was used to determine 1earning and memory in animals.Hematoxylin and eosin(H-E)staining was used to quantify neuronal death in the hippocampus.The reactive oxygen species(ROS)was assessed by using 2′,7′-dichlorodi?hydrofluorescein diacetate(H2DCF-DA).ResultsCompared with AD model group,pyruvate group showed improved gen?eral condition,shortened escape latency(41.37±6.24,31.67±7.26,24.26±7.16,20.45±5.72,19.36±5.89，respectively P＜0.05),increased activity time on the former platform quadrant(50.36±7.46 s,P＜0.05),increased number of crossing the former platform(3.98±1.23 time/2 min，P＜0.05),reduced ROS levels and decreased neuronal cell death in CA1 of the hippocampus decreased(respectively,P＜0.05).Conclusions Pyruvate can improve the learning and memory and de?crease the neuronal cell death through preventing the ROS production in AD rats.

Pyruvate Alzheimer’s disease Learning and memory

2

A

2013-08-02）

（責任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.02.006

☆ 國家自然科學基金資助項目（編號：81200246），高等學校博士學科點專項科研基金（編號：20122104120004），遼寧省自然科學基金項目(編號：2013010025-401)

* 中國醫科大學附屬第一醫院呼吸感染科（沈陽110001）