蛭龍活血通瘀膠囊對局灶性腦缺血大鼠腦組織促血管生成素－1及Tie－2表達的影響

吳 英 ，鄭 直 ，白 雪 ，楊思進 ，黃帥金

（1.瀘州醫學院附屬中醫院，四川 瀘州 646000； 2.瀘州市人民醫院，四川 瀘州 646000）

腦梗死因高發病率、高死亡率、高致殘率而成為嚴重威脅人 類生命健康的重大疾病之一，其預后與病灶微循環的改善及神經組織修復密切相關。研究發現，新形成的側支血管可改善缺血區周圍組織灌流，促進腦卒中后神經功能恢復［1］。因此，通過血管新生啟動損傷區微血管網重建是腦組織修復的重要過程。蛭龍活血通瘀膠囊由黃芪、水蛭、地龍、大血藤等組方，具有益氣、活血化瘀通絡、祛風的功效。經研究發現，蛭龍活血通瘀膠囊能明顯促進局灶性腦缺血大鼠神經功能恢復，其機制可能與促進缺血腦組織促血管生成素 －1（Ang－1）、酪氨酸激酶 －2（Tie－2）表達有關。

1 材料與方法

1.1 試藥與動物

Ang－1兔抗鼠多克隆抗體（北京四正柏生物科技有限公司，批號為110601）；Tie－2兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號為YE1030W）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京四正柏生物科技有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）。蛭龍活血通瘀膠囊（瀘州醫學院附屬中醫院制劑室，批號為20121212）；步長腦心通膠囊（咸陽步長制藥有限公司，批號為120995）。健康雄性SD大鼠150只，體重250～300 g，由瀘州醫學院動物實驗中心提供，動物合格證編號為SYXK（川2008－065），于室溫普通飼料喂養。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組

參照 Longa等［2－4］報道的線栓改良法造大腦中動脈阻塞（MCAO）動物模型，造模動物自然蘇醒后，參照Zealonga評分標準［2］進行5分制評分。評分標準：無神經損傷癥狀，0分；不能完全伸展對側前爪，1分；向外側轉圈，2分；行走時向對側傾倒，3分；不能自發行走，意識昏迷，4分。將術后24 h評分為1～3分的大鼠選入組，剔除其余動物，作隨機補充。用隨機數字表法將120只造模大鼠分為6組，即蛭龍活血通瘀膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組，步長腦心通膠囊對照組，模型組，假手術組。

1.2.2 藥物干預

蛭龍活血通瘀膠囊成人（體重按60 kg計算）的臨床用藥量為 4.8 g ／d，按人體用量的 5，10，20 倍，換算動物低、中、高劑量組的用藥量分別為0.4，0.8，1.6 g／kg；腦心通組按成人用量的10倍給藥，即0.8 g／kg。各藥物干預組均給予等體積（3mL）相應濃度的藥物灌胃，假手術組及模型組給予等體積（3mL）的生理鹽水灌胃，每日1次，連續7 d，并按體重調整給藥量。

1.2.3 指標采集及檢測方法

神經功能缺損評分：各組大鼠灌胃7 d后，依照Zealonga5分制評分方法進行神經功能缺損評分，判斷各組大鼠神經功能恢復情況。

免疫組化標本制備及檢測：腦缺血7 d后，各組大鼠以4%多聚甲醛進行腦組織固定后，SP法Ang－1及Tie－2免疫組化染色，DAB顯色。任何被Ang－1及Tie－2抗體染成棕黃色或棕褐色的細胞均視為陽性表達。

計算機圖像分析：采用Image－Pro－Plus 6.0圖像分析軟件進行圖像分析，每只大鼠隨機選取3張切片，每張切片隨機選擇3個不同視野，計數視野內陽性細胞數（被染成棕黃色或棕褐色為陽性細胞），每組所有照片的平均陽性細胞數代表該組的陽性細胞數。

1.2.4 統計學處理

采用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析（OneWay Aonva），兩兩對比采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能缺損評分

結果見表1。可見，與假手術組比較，模型組及給藥各組大鼠出現明顯神經功能缺損癥狀，神經功能缺損評分均升高。與模型組比較，活血通瘀膠囊高、中、低劑量組神經功能缺損癥狀均明顯改善，以高劑量組尤為明顯。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較（ ± s，n＝20）

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較（ ± s，n＝20）

注：與假手術組比較，★P＜0.05，▲P＜0.01；與模型組比較，●P＜0.05，◆P＜0.01；與蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組比較，◎P＜0.05。

組別假手術組模型組蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組蛭龍活血通瘀膠囊中劑量組蛭龍活血通瘀膠囊高劑量組步長腦心通對照組劑量（g／kg）001.60.80.40.8神經體征評分（分）02.98±0.98▲2.49±0.83★●2.15 ±0.87★◆◎1.94 ±0.53★◆◎2.01 ±0.74★◆◎

2.2 腦組織Ang－1及Tie－2陽性細胞計數

結果見圖1、圖2及表2。可見，Ang－1及Tie－2在假手術組腦組織血管內皮細胞陽性表達量極少。模型組大鼠腦缺血區血管內皮細胞陽性表達較假手術組增多，差異有統計學意義（P＜0.05）。蛭龍高、中、低劑量組大鼠腦缺血皮層神經細胞和血管內皮細胞陽性表達明顯增加，均強于模型組（P＜0.01或P＜0.05），以高劑量組尤為顯著。

圖1 大鼠腦組織Ang－1的表達圖像（×400）

3 討論

圖2 大鼠腦組織Tie－2表達（×400）

表2 各組大鼠腦組織Ang－1及Tie－2表達比較（ ± s，n＝20）

表2 各組大鼠腦組織Ang－1及Tie－2表達比較（ ± s，n＝20）

注：與假手術組比較，▲P＜0.05，◆P＜0.01；與模型組比較，●P＜0.05，■P＜0.01；與蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組比較，★P＜0.05。

T i e－2組別 劑量（g／k g）A n g－14.06±1.017.87±0.73▲9.84±0.60◆●13.15±1.06◆■★13.47±0.99◆■★13.12±0.66◆■★假手術組模型組蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組蛭龍活血通瘀膠囊中劑量組蛭龍活血通瘀膠囊高劑量組步長腦心通對照組0 00.40.81.60.84.47±1.3811.89±0.71▲13.88±1.37◆●19.01±0.59◆■★20.30±0.27◆■★19.48±0.58◆■★

Ang－1是一族特異性作用于血管內皮細胞的生長因子，含免疫球蛋白樣環和上皮生長因子樣域Tie－2。Tie－2為Ang－1內皮特異性酪氨酸激酶受體，Ang－1以旁分泌形式與Tie－2受體結合，觸發血管內皮細胞和血管周細胞相互作用，促進血管穩定和成熟，并維持成熟血管的完整性及靜息狀態［5］。在對腦卒中的研究中發現，缺血缺氧可誘導Ang－1／Tie－2的表達，進而調節腦損傷區微血管新生過程［6］。研究發現，腦缺血－再灌注后Ang－1表達增加，與Tie－2結合，可抑制腦微血管內皮細胞凋亡［7］，減輕血管內皮生長因子（VEGF）產生的血管通透作用，減少腦缺血后血腦屏障的滲漏，降低腦水腫的程度［8］。Ang－1除了促進腦缺血后血管新生，還可保護神經元、抑制神經細胞凋亡并刺激神經發生［9］。其機制可能為Ang－1促使PI－3激酶活化和激活絲氨酸－蘇氨酸蛋白酶，抑制胞漿內特異性識別天冬氨酸位點蛋白 － 3（Caspase －3）裂解，干預神經細胞凋亡［10］。本研究結果顯示，與模型組比較，蛭龍活血通瘀膠囊高、中、低劑量組大鼠Ang－1及 Tie－2表達明顯升高（P＜0.01或P＜0.05），表明蛭龍活血通瘀膠囊可能通過促進腦缺血區Ang－1及Tie－2表達，促進缺血區形成穩定的成熟血管網，修復神經損傷，發揮腦保護作用。

參考文獻：

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