犬瘟熱病毒檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

李忠生 王智群 馮秀娟

犬瘟熱病毒檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

李忠生 王智群 馮秀娟

犬瘟熱（CDV）在1809年由Jeneer首次報(bào)道。1905年卡爾（Carre）將分離的濾過(guò)性致病因子接種動(dòng)物從而復(fù)制出病例，1926年Laidlaw和Duncan利用完全隔離的犬和易感性高的雪貂進(jìn)行了人工感染，該試驗(yàn)肯定了本病的病原為病毒。1980年我國(guó)首次分離并獲得了犬瘟熱病毒。犬瘟熱常引起大批犬、貂、狐等動(dòng)物發(fā)病，死亡率可達(dá)30～80%，繼發(fā)細(xì)菌感染是導(dǎo)致死亡率增高的主要原因之一,若并發(fā)肺炎其死亡率可高達(dá)90%以上。國(guó)內(nèi)外對(duì)CDV進(jìn)行了大量研究, 建立了多種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。下面我們從病毒分離、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方面對(duì)犬瘟熱病毒檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行闡述。

一、病毒的分離鑒定

病毒的分離培養(yǎng)是確診犬瘟熱最根本的診斷方法。但由于CDV對(duì)外界環(huán)境的抵抗力弱，致使病毒的分離成功率很低，此外病毒分離成功率還與分離病毒的細(xì)胞、動(dòng)物的抗體水平、病料采樣的時(shí)間部位、樣品處理方法等因素有關(guān)。目前培養(yǎng)CDV的細(xì)胞有原代培養(yǎng)細(xì)胞和傳代細(xì)胞系兩類(lèi)。原代培養(yǎng)細(xì)胞主要有犬或貂的肺巨噬細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）、犬腎原細(xì)胞、牛胚胎肺細(xì)胞、犬腦細(xì)胞（DB）等；細(xì)胞系有犬腎細(xì)胞系（MDCK）、非洲綠猴腎細(xì)胞系（Vero）、貓腎細(xì)胞系（CRFK）、貓胚胎細(xì)胞系（FE）等。有報(bào)道稱(chēng)能夠表達(dá)犬淋巴細(xì)胞激活信號(hào)分子的細(xì)胞，對(duì)分離CDV非常有效，在感染細(xì)胞1天后即可檢測(cè)到病毒，極大地減少傳統(tǒng)分離方法的耗費(fèi)。病料可采用急性病例的胸腺、脾、肝、肺、淋巴結(jié)，發(fā)病早期的病例可采淋巴組織，有腦炎癥狀的病例可采小腦等。

病毒鑒定可采用電子顯微鏡對(duì)病毒粒子形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，也可以采用常規(guī)方法進(jìn)行病毒理化試驗(yàn)，還可以進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，觀察是否有犬瘟熱癥狀。

二、免疫學(xué)檢查方法

（一）瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)只能粗略地對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)定，靈敏性略差，因?yàn)椴恍枰褂锰厥鈨x器且容易操作，較適合在基層應(yīng)用。任文陟等用病死貉肝臟為抗原，以犬瘟熱雞胚成纖維細(xì)胞弱毒疫苗免疫綿羊制備瓊脂擴(kuò)散抗體，建立了瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法。該方法與電鏡檢查結(jié)果總符合率為90%。

（二）SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)

SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)主要用于感染犬瘟熱動(dòng)物血清中抗體的檢測(cè)，具有快速、特異、易于操作、樣品可長(zhǎng)期保存等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣。劉鼎新等采用這種方法和瓊擴(kuò)試驗(yàn)分別對(duì)臨床疑似犬瘟熱的病犬進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明兩種方法結(jié)果一致。劉潤(rùn)珍等制備了犬瘟熱快速診斷試劑，并確定了制備工藝及標(biāo)準(zhǔn)操作程序，3～5 min內(nèi)即可獲得診斷結(jié)果。利用糞便和尿液檢查抗原不受疫苗接種的干擾。

（三）免疫組化技術(shù)

免疫組化技術(shù)主要用于犬瘟熱的死后診斷，因其能檢測(cè)CDV在各組織臟器的分布情況，可以為檢測(cè)樣品的篩選提供依據(jù)，但其需要特異的抗體結(jié)合反應(yīng)。本法不須用熒光顯微鏡、標(biāo)本可以長(zhǎng)期保存，這些都是優(yōu)于熒光抗體法之處。顯色后的標(biāo)本可在普通顯微鏡下觀察，抗原所在部位DAB顯色液呈棕黃色，還可用常規(guī)染料作反襯染色，細(xì)胞結(jié)構(gòu)更清晰，有利于抗原的定位。遇秀玲等采用免疫組化間接BA法，對(duì)疑似CD的病犬臟器組織中的抗原進(jìn)行了定位檢查和系統(tǒng)病理學(xué)觀察，結(jié)果表明病犬的多個(gè)組織器官均可見(jiàn)抗原陽(yáng)性反應(yīng)。Gathumbi等認(rèn)為該方法也可用于石蠟包埋的組織、福爾馬林固定或培養(yǎng)物中CDV的組織學(xué)檢測(cè)。

（四）免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)是指用熒光素標(biāo)記抗原或抗體，用熒光顯微鏡觀察熒光以示蹤相應(yīng)的抗原或抗體的方法。本方法具有反應(yīng)特異性、染色快速等特點(diǎn)，可在細(xì)胞水平上進(jìn)行抗原定位，是目前國(guó)際通用的診斷CDV的公認(rèn)手段。

Coffin等建立免疫熒光方法來(lái)診斷犬瘟熱，認(rèn)為該方法可促進(jìn)犬瘟熱的特異性診斷，但是需要特殊設(shè)備，且通常需要在專(zhuān)門(mén)的試驗(yàn)室中進(jìn)行。在試驗(yàn)室中可用直接或間接熒光素標(biāo)記的CDV抗體染色，并用熒光顯微鏡進(jìn)行檢查。

（五）血清中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)是根據(jù)抗體能否中和病毒的感染性而建立的免疫學(xué)試驗(yàn)，敏感性高、特異性強(qiáng)，是診斷CD、評(píng)價(jià)CD疫苗免疫效果、監(jiān)測(cè)免疫犬抗體水平的標(biāo)準(zhǔn)方法。Appel等利用微量血清中和試驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)此方法具有很高的敏感性和特異性。血清中和試驗(yàn)雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但試驗(yàn)所需時(shí)間較長(zhǎng)，工作量大，通常需幾天，因此不利于CDV快速診斷。

（六）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

目前ELISA是已用于感染犬血清和腦脊液中病毒性抗原的檢測(cè)。其過(guò)程是將抗原（或抗體）吸附于固相載體上，然后進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，底物顯色后用分光光度計(jì)或肉眼判斷結(jié)果。ELISA方法包括間接法、夾心法、雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法等，該方法具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，在CD的流行病學(xué)調(diào)查和CD的免疫情況評(píng)估工作中常用到該方法，尤其適合規(guī)模很大的樣品的檢測(cè)。Blixenkrone-Moller等建立了檢測(cè)抗犬瘟熱病毒IgM的ELISA，用于犬和水貂CDV早期感染的檢測(cè)。傳統(tǒng)的ELISA方法用犬瘟熱病毒細(xì)胞培養(yǎng)物做包被抗原，CDV在細(xì)胞上繁殖量低而且抗原提純難度較大，用基因技術(shù)有望解決這一難題。簡(jiǎn)中友等用重組N蛋白作為包被抗原建立了檢測(cè)CDV抗體的間接ELISA方法，并與進(jìn)口診斷試劑盒比較，符合率分別為92.4%、97.1%。為免疫犬群抗體檢測(cè)、CDV的早期診斷和CDV流行病學(xué)調(diào)查提供了一種簡(jiǎn)便的血清學(xué)診斷方法。

（七）免疫膠體金技術(shù)

1971年，F(xiàn)aulk和Taylon將兔抗沙門(mén)氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)研究沙門(mén)氏菌壁細(xì)胞抗原成分，首次將膠體金標(biāo)記技術(shù)引入免疫化學(xué)。此后，膠體金作為新型免疫標(biāo)記技術(shù)快速發(fā)展，許多學(xué)者進(jìn)一步證實(shí)膠體金穩(wěn)定又能迅速吸附蛋白質(zhì)，可以作為探針精確定位細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、激素、抗原等生物大分子。進(jìn)入20世紀(jì)90年代初期，免疫膠體金又與固相膜結(jié)合發(fā)展了以膜為固相載體的免疫膠體金快速診斷技術(shù)，它是當(dāng)前快速敏感的免疫檢測(cè)技術(shù)之一，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

膠體金標(biāo)記抗體實(shí)質(zhì)是抗體被膠體金顆粒吸附到表面的過(guò)程，這種吸附屬于物理性吸附，對(duì)抗體生物活性影響很小，容易獲得較高的標(biāo)記率；而膠體金不屬于生物活性物質(zhì)，大大減少了干擾檢測(cè)結(jié)果的因素。膠體金免疫層析技術(shù)是用于肉眼水平的免疫檢測(cè)，具有試劑和樣本用量小、肉眼易判斷、攜帶方便、敏感度和特異性高、結(jié)果可長(zhǎng)期保存、不需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)大量樣本的檢測(cè)。用膠體金標(biāo)記抗CDV的單克隆抗體，然后與樣品中的CDV結(jié)合，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的紅色條帶。該法靈敏度高、特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確、易于判讀。

三、分子生物學(xué)診斷方法

分子生物學(xué)的發(fā)展為犬瘟熱的研究開(kāi)辟了新的途徑，并提供了多種新的檢測(cè)方法和手段，CDV致病機(jī)理、分子病毒學(xué)以及免疫學(xué)等許多相關(guān)研究得以迅速的發(fā)展，其中分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究也得到快速的發(fā)展，但這些診斷方法尚處在試驗(yàn)室階段。利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆表達(dá)CDV主要的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，盡快研制出特異性診斷抗原或特異核酸探針，對(duì)本病的診斷有重要意義，該技術(shù)將來(lái)有著廣闊的前景和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

（一）核酸雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)是將具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單股核酸分子放入同一反應(yīng)體系中，兩條互補(bǔ)鏈重新締合成雙鏈。該技術(shù)也是一種分子雜交技術(shù)，是免疫學(xué)診斷技術(shù)后發(fā)展的一項(xiàng)以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的新技術(shù)，具有敏感性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。Zurbriggen等用地高辛標(biāo)記的CDV N基因互補(bǔ)的特異性RNA做為探針，可檢測(cè)到單個(gè)感染細(xì)胞中存在的目的核酸序列，特異性較強(qiáng)。李金中等根據(jù)Barret報(bào)道的CDV Onderstepoort株F基因序列，在國(guó)內(nèi)首次建立了犬瘟熱病毒RT-PCR診斷方法，并成功的應(yīng)用于臨床診斷。盡管此種方法具有很多優(yōu)點(diǎn)，但核酸雜交技術(shù)受設(shè)備、操作人員等多種條件的影響而難于在臨床推廣。

（二）PCR技術(shù)

PCR技術(shù)能對(duì)病毒特異性核酸片段進(jìn)行檢測(cè)，具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病毒檢測(cè)。其中反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)診斷法的敏感性和特異性均高于傳統(tǒng)診斷方法，因而RTPCR廣泛應(yīng)用于臨床樣品中的病毒檢測(cè)。尤其在犬瘟熱發(fā)病早期，對(duì)機(jī)體特異性免疫抗體無(wú)法檢測(cè)時(shí)RTPCR非常有效。

Chulakasian等根據(jù)F基因、M基因之間非編碼區(qū)的區(qū)別設(shè)計(jì)多重?cái)U(kuò)增穩(wěn)定突變體系PCR方法（ARMSPCR）也能達(dá)到區(qū)分自然感染后發(fā)病還是疫苗引起的癥狀的目的。黃國(guó)君等和Gabriella等等分別建立SYBR Green Real-time RT-PCR和 TaqMan Real-time RT-PCR檢測(cè)CDV，均獲得較高的敏感性和特異性，最小檢測(cè)量為100個(gè)RNA，動(dòng)物的各種組織和器官均可用來(lái)檢測(cè)。

四、其它實(shí)驗(yàn)室方法

（一）離子捕獲電鏡檢查法

采用電鏡是直接檢測(cè)CDV的一種簡(jiǎn)便、快速的方法，但很難與同科的其他病毒相區(qū)別，所以一般不作為常規(guī)手段。離子捕獲電鏡檢查法通過(guò)濃縮和提純病毒而提高檢出率，比常規(guī)電鏡技術(shù)的結(jié)果好，且只需2～3 h，快速準(zhǔn)確。常國(guó)權(quán)等用離子捕獲電鏡技術(shù)檢測(cè)CDV，結(jié)果顯著好于常規(guī)電鏡技術(shù)。房紅瑩等改良了離子捕獲電鏡法，將其與免疫電鏡技術(shù)結(jié)合，效果又比單純離子捕獲電鏡法好，提高了完整CDV粒子的檢測(cè)率。

（二）包涵體檢查法

包涵體的檢查是診斷CD的重要輔助方法。因?yàn)镃DV與狂犬病病毒、犬傳染性肝炎病毒等所形成的包涵體及細(xì)胞某些反應(yīng)產(chǎn)物難以區(qū)分，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，所以還要與其它方法相結(jié)合才能確診。未死亡的病犬，刮取鼻、眼結(jié)膜、瞬膜和膣等粘膜；死亡的犬，刮取膀胱、膽管、膽囊等黏膜。包涵體大多存在于胞漿內(nèi)，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可能有1～10個(gè)圓形或橢圓形的包涵體。程世鵬等研究發(fā)現(xiàn)包涵體在用強(qiáng)毒的狐和貂的膀胱黏膜涂片中存在，而注射疫苗組和對(duì)照組則包涵體的存在。Kolbl等在研究病犬的血液變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，在染色的血液涂片中常能檢出包涵體，其中淋巴細(xì)胞檢出少，單核細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞和紅細(xì)胞檢出更少。

（作者單位:李忠生、馮秀娟，公安部南京警犬研究所,210012）
（王智群， 南京金盾動(dòng)物藥業(yè)有限責(zé)任公司,210012）