UPLC-DAD-Q-TO F-M S/M S測定緩解體力疲勞類保健品中非法添加的化學物質

張圓 郝剛 閔春艷 吳楊 袁燦陽 顧炳仁

（1蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇蘇州 215104；2江陰市利港醫院，江陰 214444）

UPLC-DAD-Q-TO F-M S/M S測定緩解體力疲勞類保健品中非法添加的化學物質

張圓1郝剛1閔春艷1吳楊1袁燦陽2顧炳仁1

（1蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇蘇州 215104；2江陰市利港醫院，江陰 214444）

目的：利用超高效液相-串聯四級桿-飛行時間液質聯用系統（UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS），建立快速可靠靈敏的測定緩解體力疲勞類保健食品中違法添加西地那非、他達拉非、伐地那非、紅地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他達拉非、偽伐地那非、硫代艾地那非、那紅地那非和育亨賓等12種化學藥品的液質聯用檢測方法。方法：采用UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS液質聯用儀，以Agilent ZORBAX Eclipse plus C18為色譜柱；以0.1%甲酸-0.01 mol/L乙酸銨水溶液和甲醇梯度洗脫，流速為0.3 m L/min；ESI正離子模式，一級、二級質譜全掃描，進行UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS的定性及定量分析。結果：經方法學驗證，本方法在2～80 μg/m L濃度范圍內線性良好、精密度（RSD%）小于2%、回收率在80.5%～98.7%之間。結論：本方法快速、準確、靈敏度高、分離度高，為快速篩查緩解體力疲勞類保健食品中非法添加化學物質提供有力工具。

超高效液相-串聯四級桿-飛行時間液質聯用儀；緩解體力疲勞；非法添加的化學物質

治療男性性功能障礙的各種選擇性磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制劑類藥物層出不窮，該類藥物對并發心血管系統疾病和糖尿病患者有嚴重不良反應，故須在醫生指導下使用。由于補腎壯陽類藥物的高額利潤，加之其合成路線早已不是秘密，因此，一些不法分子為牟取暴利，非法添加此類化學成分進入保健食品，宣稱具有補腎壯陽功效[1]。西地那非已成為中國保健品市場最常見的非法添加藥物[2]。緩解體力疲勞類保健品中非法添加PDE-5抑制劑會蒙蔽該類藥物有針對性的使用群體和適宜劑量，以“短暫的好轉”帶來“巨大的副作用”。本研究旨在為打擊非法添加化學物質開發專屬性強，靈敏度高的快篩快檢的方法。

目前，國內外致力于采用多種方法打擊緩解體力疲勞類保健食品中非法添加的PDE-5抑制劑的行為。高效液相色譜法（HPLC），氣相色譜（GC）-質譜（MS），液相色譜（LC）-質譜（MS），核磁共振掃描（NMR），離子遷移譜，LC-三重串聯四級桿（QQQ），LC-傅里葉變換紅外光譜（FTIR）-MS，超高效液相色譜（UPLC）-飛行時間（TOF）-MS，紅外等手段廣泛用于PDE-5抑制劑的篩查和鑒定[3-12]。日前國家食品藥品監督管理總局發布了1個藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件（編號2009030），對緩解體力疲勞類（補腎壯陽類）保健食品和中成藥進行非法添加化學藥品的篩查和驗證，包括11種化學藥品，一個分析周期耗時45 m in。

本研究利用UPLC快速高效分離分析的特點，結合四級桿（Q）-TOF高分辨質量分辨的能力，具有極高的選擇性，為保健食品中非法添加化學物質的篩查和檢測提供了強有力的工具，實現了高靈敏度和高通量的結合。

1 實驗材料

1.1 儀器和試劑

美國安捷倫公司1290 Infinity-6538-Q-TOF超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜聯用儀；ML204電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）；M illipore公司M illi-Q純水儀。Q-TOF定性軟件：Mass Hunter Workstation Software Qualitative Analysis Version B.05.00 Build 5.0.519.13。PCDL軟件：Mass Hunter PCDL Manager Version B.04.00 Build 92.0。

甲醇，MERCK公司，LC-MS級；乙酸銨，SIGMAALDRICH公司，LC-MS級；水為M illi-Q純水儀制去離子水。

1.2 對照品與樣品

西地那非、他達拉非、伐地那非、紅地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他達拉非、偽伐地那非、硫代艾地那非、那紅地那非和育亨賓12種對照品均來自TORONTO RESEARCH CHEM ICALS INC，純度大于99%。

8批樣品均來自于各市食品藥品監督管理局市場抽樣。

2 實驗步驟

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱；DAD（二極管陣列）檢測器，檢測波長230 nm；掃描波長范圍190～400 nm，步長（step）：2 nm。流動相：0.1%甲酸-10 mmol乙酸銨水溶液（A）、甲醇（B），流速：0.3 m L/m in；柱溫：30℃。進樣體積：1 μL。洗脫梯度：時間（m in）/B（%）：0 m in 10%，5 min 50%，9 m in 50%，13 m in 70%，15m in 70%，20min 95%。12種對照品的色譜分離情況見圖1。

圖1 12種對照品的混標一級提取離子流（EIC）色譜疊加圖

2.2 質譜條件

電噴霧離子化源（ESI）；毛細管溫度350℃；干燥氣流量10 L/m in；霧化氣壓力40 psi；噴霧電壓3 500 V；碎裂電壓（fragmentor）電壓135 V；正離子檢測方式；掃描方式為全掃描一級質譜、全掃描二級質譜。12種緩解體力疲勞類保健食品非法添加化學物質的分子式、準分子離子精密質量、碰撞能量和碎片離子信息如表1所示。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱定12種對照品各約5 mg，分別置10 m L量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為單標儲備液。再分別取1 m L單標置同一50 m L量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成含上述各對照品10 μg/m L的混合標樣，供進樣分析用。

2.4 供試品溶液的制備

若供試品為固體制劑，精密稱取一次服用量，研細后轉移至10 m L量瓶中，加甲醇約8 m L，超聲處理15 m in，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，取適量上清液，10 000 rpm離心5 min，取上清液100 μL用甲醇稀釋至1 m L，即得。

若供試品為液體制劑，精密量取2 m L，置10 m L量瓶中，加甲醇約8 m L，振搖3 min，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。量取續濾液適量于離心管中，10 000 rpm離心5 m in，取上清液100 μL用甲醇稀釋至1 m L，即得。

表1 12種非法添加化學物質分子式、準分子離子精密質量、碰撞能量和碎片離子

由于供試品檢測前的濃度未知，故若其檢測濃度超出方法的線性范圍，則用甲醇進行稀釋，以稀釋后溶液進行定量。

3 方法學驗證

按照上述實驗步驟，對方法的專屬性、線性范圍和檢出限、精密度、準確度進行了考察。對照品儲備液稀釋后按上述液質聯用條件測定，按信噪比S/N=3計算各化合物的檢出限，各成分檢出限在2.170～53.57 ng/m L。取同一濃度混合對照品溶液，連續進樣6次，計算一級EIC圖譜中峰面積相對標準偏差，以評價精密度。取12種對照品混標溶液，分別稀釋，配制成含12種對照品各2，5，10，20，50，80 μg/m L的標準曲線工作溶液，以峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸。取陰性樣品1次服用量的內容物6份，分別加入一定量對照品，按樣品處理方法同法處理測定回收率。測定結果見表2。

表2 12種非法添加化學物質的線性方程、相關系數和檢出限

4 樣品測定

將市場上抽查的8批樣品，按照2.4方法處理樣品，并用UPLC-二極管陣列檢測（DAD）-Q-TOF-MS/MS處理樣品。比較樣品和對照品的一級、二級質譜掃描圖，結合DAD光譜圖，判斷樣品中是否含有非法添加物質。結果如表3所示，在8種樣品中3批檢出陽性。

5 討論

5.1 色譜條件的優化

在12個PDE-5抑制劑對照品中，豪莫西地那非和伐地那非、偽伐地那非和那莫西地那非分別為兩組分子式相同的物質，其準分子離子[M＋H]+的精密質量也相同，故必須在液相色譜上完全分離，本實驗對流動相梯度和比例進行不斷優化，最終使得精密質量相同的組分完全分離。各化合物的保留時間均大于5 m in，盡量避免因復雜基質影響而產生假陽性現象。

5.2 膠囊殼的測定

由于某些非法商家在膠囊殼中添加抗疲勞類藥物，所以膠囊殼中非法添加化學物質的測定很有必要。其測定方法為將膠囊內容物取出后，取一定量的膠囊殼按照2.4進行同法處理。4批膠囊殼均未檢出非法添加物。

表3 8批樣品信息及測定結果

5.3 不同溶劑處理樣品對實驗影響的研究

本實驗考察了甲醇和乙腈作為提取溶劑對測得結果的影響，結果表明，不同提取溶劑對實驗結果無顯著影響。

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Detection of Illegally Added Chem icals in Anti-fatigue Health Foods by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS M ethod

Zhang Yuan1，Hao Gang1，M in Chunyan1，Wu Yang1，Yuan Canyang2，Gu Bingren1（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215000，China；2 Ligang Hospital of Jiangyin City，Jiangyin 214444）

Objective:To establish a fast，accurate and sensitive method by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS for the detection of 12 kinds of illegally added chemicals in anti-fatigue health foods，such as sildenafil，tadalafil，vardenafil，acetildenafil，homosildenafil，hydorxyhomosildenafil，norneosildenafil，am inotadalafil，pseudovardenafil，thioaildenafil. noracetildenafil，and yohimbine.Methods:Agilent ZORBAX Eclipse plus C18analysis column was used with mobile phase of 0.01 mol/L ammonium acetate aqueous solution（containing 0.1%form ic acid）-methanol and gradient elution，the flow rate was 0.3m L/m in.ESI+scan and MS/MS mode were taken.Qualitative and quantitative analyses were carried out by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS.Results:The method was validated.A good linear relationship was showed in the concentration of 2～80 μg/m L，（RSD＜2%）and the recovery was obtained in range of 80.5%～98.7%.Conclusion：This method is fast，accurate and sensitive with a high degree of separation，it can be used as a powerful tool for the fast detection of illegally added chemicals in anti-fatigue health foods.

UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS；Anti-Fatigue Preparations；Illegally Added Chemicals

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.08.004

2014-07-07）

蘇州市科學技術局科學計劃項目（SS201220）

張圓，女，碩士。研究方向：藥物分析。E-mail：zhangyuan213@sina.com

顧炳仁，男，碩士生導師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：944757490@qq.com