反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定金銀花中的綠原酸和木犀草苷方法的優(yōu)化

劉文靜 潘葳 涂杰峰 楊繼偉

摘要 [目的]研究反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定金銀花中的綠原酸和木犀草苷的優(yōu)化色譜條件。[方法]采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）同時(shí)測(cè)定金銀花中綠原酸和木犀草苷含量，并對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]最佳色譜條件為色譜柱Waters SunFireTMC18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）、柱溫40 ℃，流動(dòng)相為乙腈-0.5%冰醋酸，梯度洗脫為0～15 min（10∶90～20∶80）、16～17 min（20∶80～10∶90），流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)0～15 min 328 nm、16 ～17 min 350 nm。[結(jié)論]優(yōu)化后縮短了測(cè)試時(shí)間，為金銀花質(zhì)量的快速檢測(cè)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 反相高效液相色譜法；金銀花；綠原酸；木犀草苷；優(yōu)化

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）26-08948-03

Optimization of the Determination Method of the Chlorogenic Acid and Luteolin-7-O-glucoside in Flos Lonicerae by RP-HPLC

LIU Wen-jing， PAN Wei et al （Central Laboratory， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003；Fujian Key Laboraotory of Precision Measurement of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350003）

Abstract [Objective] The research aimed to study the optimal chromatographic conditions of the deter mination method of the chlorogenic acid and luteolin-7-O-glucoside in flos lonicerae by RP-HPLC. [Method] A RP-HPLC method with UV detector was established and optimized to deter mine the chlorogenic acid and luteolin-7-O-glucoside in Flos Lonicerae. [Result] The chromatographic conditions were： Waters SunFireTMC18 （4.6 mm× 250 mm， 3.5 μm） used for column（at 40 ℃）with 0.5% acetic-acetonitrile.Linear gradient elution： 0-15 min（10∶90～20∶80），16-17 min（20∶80～10∶90）， flow rate ：1 ml/ min， deterction wavelength：0-15 min 328 nm，16-17 min 350 nm. [Conclusion] After optimization， the test time was shortened.The study provides the reference for deter mination method of rapid detection of flos lonicerae quality.

Key words RP-HPLC；Flos lonicerae；Chlorogenic acid；Luteolin-7-O-glucoside；Optimization

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥后的花蕾或初開的花，是我國(guó)常用的清熱解毒傳統(tǒng)中藥，其味甘、性寒，具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱之功效^[1]。金銀花中主要活性成分為綠原酸以及木犀草苷為代表的黃酮類成分^[2]，目前對(duì)金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量的測(cè)定主要是以高效液相色譜（HPLC）為主^[3-7]，但大部分方法測(cè)試分析時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，增加了檢測(cè)工作量；且色譜峰不易分開，峰形分離度也不理想^[8]。該試驗(yàn)建立高效液相轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)法，同時(shí)測(cè)定金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量，通過(guò)優(yōu)化色譜條件，以期更為簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)這2種有效成分的含量，為金銀花質(zhì)量的快速檢測(cè)分析提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料 金銀花由福建省科技廳農(nóng)牧業(yè)科研中試中心提供。

1.2 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列（PDA）檢測(cè)器，Waters Empower色譜工作站，MILLIPORE超純水器，中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司），超聲波清洗器KQ-250DB （昆山市超聲儀器有限公司），離心機(jī)Microfuge UV（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司），電子分析天平AL24（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），微量可調(diào)移液器（eppendorf）。

1.3 試劑及其配制

乙腈色譜純，無(wú)水乙醇、冰醋酸為優(yōu)級(jí)純，綠原酸（Sigma，純度≥98%，美國(guó)），木犀草苷（Sigma，純度≥98%，美國(guó)），所有試驗(yàn)用水為超純水（蒸餾水再經(jīng)過(guò)Millipore超純水系統(tǒng)制備）。

1.3.1 70%乙醇水溶液。移取無(wú)水乙醇700 ml，用超純水稀釋并定容至1 000 ml。

1.3.2 0.5% 醋酸溶液。移取冰醋酸5 ml，用超純水稀釋并定容至1 000 ml，然后用0.45 μm孔徑的水相濾膜過(guò)濾，再經(jīng)超聲脫氣，即為流動(dòng)相B，過(guò)濾乙腈為流動(dòng)相A。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制。精密稱取綠原酸0.018 5 g，用70%乙醇水溶液定容至10 ml， 制成濃度為1.81 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密稱取木犀草苷0.020 6 g用70%乙醇水溶液定容至50 ml，制成濃度為0.404 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。取上述儲(chǔ)備液各1.0 ml于同一10 ml棕色容量瓶中，用70%乙醇水定容，制成綠原酸濃度181 μg/ml和木犀草苷濃度40.4 μg/ml的混合工作液1。取上述儲(chǔ)備液各1.0 ml于同一100 ml棕色容量瓶中，用70%乙醇水定容，制成綠原酸濃度18.1 μg/ml和木犀草苷濃度4.04 μg/ml的混合工作液2。

1.4 樣品前處理

金銀花樣品經(jīng)60 ℃烘干，粉碎，過(guò)40目篩。稱取0.5 g于50 ml棕色容量瓶中，用70%乙醇水溶液定容，搖勻，超聲提取30 min，過(guò)濾。取一定量的濾液，10 000 r/min高速離心10 min，分離沉淀干擾物質(zhì)，取上清液用0.45 μm孔徑的濾膜過(guò)濾，濾液供上機(jī)分析，分析時(shí)進(jìn)樣10 μl。

1.5 色譜條件的優(yōu)化

1.5.1 流速。

使用色譜柱Waters SunFireTMC18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），柱溫40 ℃，比較了不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）對(duì)綠原酸和木犀草苷分離情況的影響。

1.5.2 流動(dòng)相。

色譜柱選擇Waters SunFireTMC18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），柱溫40 ℃，流速為1.0 ml/min，考察3種流動(dòng)相梯度變化對(duì)綠原酸和木犀草苷分離情況的影響：①0～10 min（10%～25%A）、11～20 min（25%～10%A）；②0～15 min（10%～20%A）、16～20 min （20%～10%A）；③0～10 min（10%～15%A）、11～20 min（15%～10%A）。

1.5.3 檢測(cè)波長(zhǎng)。采用二極管陣列檢測(cè)器在210～400 nm范圍采集紫外吸收光譜圖，檢測(cè)對(duì)綠原酸和木犀草苷的最大吸收波長(zhǎng)。

1.6 檢測(cè)效果分析

以最佳的色譜條件測(cè)定幾種金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量，并分析測(cè)試方法線性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化確定

2.1.1 流速確定。

綠原酸隨著流速增加出峰提前，分離度影響不大，木犀草苷在1.0 ml/min分離效果最好。流速低分離時(shí)間較長(zhǎng)，雜質(zhì)不易分離，流速增大則會(huì)增加系統(tǒng)的壓力，效率低。該試驗(yàn)通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，流速為1.0 ml/min時(shí)，系統(tǒng)壓力適中，靈敏度也足夠高，所以該方法確定流速為1.0 ml/min。

2.1.2 流動(dòng)相確定。試驗(yàn)結(jié)果表明（圖1），選擇“1.5.2”中第1種梯度變化作為流動(dòng)相時(shí)，因乙腈有機(jī)相占比例較大，樣品出峰較快，木犀草苷與前面雜質(zhì)不能完全分離；而選擇第3種梯度變化因水相占比例較大，樣品出峰慢，木犀草苷與后面雜質(zhì)峰不能完全分離，而綠原酸在有機(jī)相比例較大時(shí)出峰較快，水相增大時(shí)出峰保留時(shí)間延長(zhǎng)，考慮木犀草苷的分離情況故選擇第2種流動(dòng)相，因木犀草苷在15 min左右出峰，故不需設(shè)置20 min，最終流動(dòng)相為0～15 min（10%～20%A）、16～17 min （20%～10%A）。

2.1.3 波長(zhǎng)確定。

檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，綠原酸在325.7 nm處有最大吸收值，考慮到儀器的穩(wěn)定性，故選定檢測(cè)波長(zhǎng)為328 nm；木犀草苷在348.4 nm處有最大吸收值，故選定檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。

3 討論與結(jié)論

（1）此試驗(yàn)綠原酸和木犀草苷含量測(cè)定方法參照《中國(guó)藥典》2010年版一部，按照藥典的梯度洗脫程序，木犀草苷與相鄰雜質(zhì)峰分離不好，無(wú)法得到較好的色譜峰，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏大。該試驗(yàn)通過(guò)設(shè)置不同檢測(cè)條件，保證綠原酸較快出峰的前提下，使木犀草苷能與相鄰雜質(zhì)峰分離干凈，目標(biāo)峰形較好，與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離。

（2）采用HPLC法測(cè)定金銀花中綠原酸和木犀草苷已有較多報(bào)道，但測(cè)定時(shí)間普遍較長(zhǎng)，一般均需25 min以上^[5-7]， 增加了檢測(cè)工作量，該試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化色譜條件，能夠在較短時(shí)間內(nèi)（16 min左右）得到理想的結(jié)果，縮短了檢測(cè)時(shí)間。

（3）用該方法中金銀花中綠原酸和木犀草苷的回收率均大于96.0%，RSD值小于1%，回收率和重現(xiàn)性均可滿足定量分析要求。該試驗(yàn)建立的HPLC法檢測(cè)金銀花中2種成分的含量快速易行，可為金銀花質(zhì)量的快速檢測(cè)分析提供一定的參考。

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