細(xì)胞穿透肽Tat—LK15介導(dǎo)siRNA的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性研究

饒 云 彭 捷 吳昊澎 曹仲文 陸建華 屠偉峰

摘 要：通過與Lipofectamine TM RNAiMAX（Lipo）比較，探討細(xì)胞穿透肽Tal-LK15對人腎上皮細(xì)胞（human enbryonic kidney 293T cells，293T）和大鼠視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell ling，RGC-5）轉(zhuǎn)染小干擾RNA（smallinterfernce RNA，siRNA）的效率和細(xì)胞毒性，為后期實驗提供依據(jù)。以羧基熒光素（carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）標(biāo)記的siRNA為報告基因，不同劑量的Tat-LK15 （Tat-LK15組）和Lipo（Lipo組）為轉(zhuǎn)染試劑，分別轉(zhuǎn)染293T和RGC-5細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡觀察FAM熒光強度，計算轉(zhuǎn)染效率，并以CCK-8法檢測細(xì)胞毒性。隨著Tat-LK15 和Lipo劑量的增加，siRNA轉(zhuǎn)染效率逐漸提高。 當(dāng)Tat-LK15與siRNA配比為2：1（μg/μg）時，RGC-5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高（（87.3±4.5）%），低于Lipo與siRNA配比為5：1（μL/μg）時的最高轉(zhuǎn)染效率（（96.2±3.2）%（P<0.05））；作用于293T細(xì)胞時，兩轉(zhuǎn)染試劑的最高轉(zhuǎn)染效率沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>O.05）轉(zhuǎn)染試劑劑量增加，Lipo細(xì)胞毒性顯著增加，而TaI-LK15毒性無明顯變化。轉(zhuǎn)染效率最高時，Lipo（5μL）組293T和RGC-5的細(xì)胞荷活率僅為（（77.8±4.1）%，（73.4±7.7）%）顯著低于Tal-LK15 （2：1）組同種細(xì)胞的存活率（（91.0±3.7）%.（90.0±6.1）%）（P<0.05） Tat-LK15可有效地轉(zhuǎn)染siRNA，細(xì)胞毒性低，安全性突出.有一定的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞穿透肽（CPPs）：Tat-LK15；轉(zhuǎn)染試劑：小干擾RNA

中圖分類號：R318

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007—7847（2014）06一0505一06

RNA干擾技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中已被廣泛應(yīng)用，而轉(zhuǎn)染試劑作為其關(guān)鍵因素一直得到大量關(guān)注。常用的小干擾RNA （siRNA）轉(zhuǎn)染方法有病毒載體法、陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法和陽離子聚合物法。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但其制備過程復(fù)雜、價格昂貴，免疫原性和生物安全性問題也限制了它的應(yīng)用。陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對較高，亦可能干擾細(xì)胞代謝。動物實驗表明，在體使用陽離子脂質(zhì)體可誘發(fā)肺部炎癥，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重肺損傷。陽離子聚合物安全窗小，當(dāng)需要提高轉(zhuǎn)染效率而增加轉(zhuǎn)染試劑劑量時，會明顯增加其生物毒性。細(xì)胞穿透肽是一類由30個或更少氨基酸組成的富含堿性氨基酸、帶正電荷的短肽，可高效介導(dǎo)小分子（蛋白、肽、核酸等）進(jìn)入不同類型的細(xì)胞而發(fā)揮生物活性。作為載體工具，細(xì)胞穿透肽在基因治療及新藥開發(fā)等領(lǐng)域具有很大的研究和應(yīng)用價值。

HIV-Tat是一段由人類免疫缺陷病毒I型基因編碼的反式轉(zhuǎn)錄激活因子（transactivator oftranscription， Tat），具有細(xì)胞穿透肽活性，能將與之連接的核酸、多肽等以濃度依賴的方式高效快速地導(dǎo)入胞內(nèi)，且不影響細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能；具有轉(zhuǎn)染效率高、毒性低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。本實驗為提高Tat的轉(zhuǎn)染效率，選擇Tat蛋白中具有穿膜功能的核心氨基酸序列（49～57，RKKR-RQRRR）與膜活化蛋白LKI5 （KLLKLLLKLLLKL-LK）融合.合成序列為RKKRRQRRRCJGGKLLKL-LLKLLLKLLK的新型細(xì)胞穿透肽Tat-LK15。為研究Tat—LK15的轉(zhuǎn)染效果，本實驗擬以最常用的陽離子脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TMRN_AiMAX （Lipo）為對照，轉(zhuǎn)染羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的siRNA，通過熒光顯微鏡觀察Tat-LK15的轉(zhuǎn)染效率，并通過CCK-8法檢測其細(xì)胞毒性。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎上皮細(xì)胞（293T）和大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5（廣州萊德爾牛物科技有限公司）、FAM-siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）、Tat-LK15（廈門博欣生物科技有限公司）、Lipofec-tamine TM RNAiMAX （Invitrogen，美國）、胎牛血清（Hyclone，美國）、DMEM-高糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國）、DMEM -F12培養(yǎng)基（Hyclone，美國）、Opti -MEM培養(yǎng)基（invilrogen，美國）、青鏈霉素（Hyclone，美國）、PBS磷酸鉀緩沖液（Hyclone，美國）、CCK-8溶液（碧云天，上海）、酶標(biāo)儀（Biocell，奧地利）、細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo，美國）、低速離心機（中佳，北京）、倒置光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CKX41，日本）、超凈工作臺（AIR TECH，日本）、倒置熒光顯微鏡（Leica，德國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

293T細(xì)胞使用DMEM -F12培養(yǎng)基（添加10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素）、RGC-5細(xì)胞使用DMEM-高糖培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素），置于含5%C02、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染前l(fā) d，胰酶消化293T細(xì)胞、RGC-5細(xì)胞并計數(shù)，每孔lxl05接種于24孔培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日細(xì)胞密度為300/c～50%左右。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞去完全培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，加250 μLOpti-MEM培養(yǎng)基準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。Opti-MEM培養(yǎng)基125 μL稀釋0.3 μg FAM-siRNA（終濃度50nmol/L）； Tat-LK15組：Opti-MEM培養(yǎng)基125 μL稀釋Tat-LK15，Tat-LKl5與siRNA的質(zhì)量比分別為1：2 .3：4、1：1、4：3、2：1 （μg/μg），Lipo組：Opti-MEM培養(yǎng)摹125μL稀釋Lipo，Lipo 與siRNA劑量比分別為1：1、2：1、3：1、4：1、5：1 （μL/μg）。siRNA溶液和轉(zhuǎn)染試劑溶液混合靜止20min后加到相心細(xì)胞培養(yǎng)板中，終培養(yǎng)基500μL；各實驗組設(shè)置4個復(fù)孔。4 h后吸去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，每孔加入500 μL完全培養(yǎng)基后置于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 基因轉(zhuǎn)染效率測定

轉(zhuǎn)染后24 h，倒置熒光顯微鏡檢測FAM顯色并拍照。倒置熒光顯微鏡計算轉(zhuǎn)染效率：每孔尋找3個代表性視野，各觀察100個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞率。普通視野下計得細(xì)胞數(shù)為N，相同視野換熒光下計得熒光細(xì)胞數(shù)為n轉(zhuǎn)染效率=n/N×100%。

1.2.4 CCK一8檢測細(xì)胞毒性

轉(zhuǎn)染后24 h將各孔細(xì)胞胰酶消化后分別吸出，每孔按l×10 4細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板置于5%C02、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出96孔細(xì)胞板去日培養(yǎng)，用新鮮DMEM培養(yǎng)摹清洗2次，加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h：以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照孔，符組設(shè)置6個復(fù)孔，酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm的吸光度（OD），并計算細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率=轉(zhuǎn)染組細(xì)胞（OD）對照組細(xì)胞0D×100%）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSSl3.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析（ANOVA）F檢驗對相關(guān)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計處理，多樣本均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率

隨著Tat-LK15和Lipo劑量增加轉(zhuǎn)染效率增高，但是增長趨勢減小。在Tat -LK15組，Tat -LK15與siRNA比例為4：3—2：1 （μg/μg）時，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，Tat-LK15/siRNA為4：3和2：1時兩交聯(lián)比的293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率無明顯差異（P>0.05，見表1、圖1）；RGC-5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率也無明顯差異（P>0.05，見表l、圖2）。Lipo與siRNA為5：1（μL/μg）時兩細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高。作用于293T細(xì)胞時，Tat-LK15（2：1）轉(zhuǎn)染效率為（93.1±3.0）%與Lipo （5：1）組（98.2±1.6）%差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，見表l、圖3、4）作用于RGC-5細(xì)胞時，Tat -LK15（2：1）組轉(zhuǎn)染效率（87.3±4.5）%低于Lipo （5：1）組（96.2±3.2）%（P<0.05.見表l、圖5、6）；但是與Lipo （4：1）組轉(zhuǎn)染效率為（90.1±4.2）%比較無顯著差異（P>0.05）。Tat-LK15對于介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染具有良好的轉(zhuǎn)染效率.（見表l、圖1～6）。

2.2 細(xì)胞毒性

兩種轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性隨劑量增加而增強，并呈劑量依賴性。Tat-LK15對293T和RGC-5細(xì)胞抑制率較小，轉(zhuǎn)染24 h后無明顯細(xì)胞毒性（圖7、8黑色柱）；Lipo對細(xì)胞具有一定毒性，隨劑量增加細(xì)胞仔活率明顯下降（圖7、8灰色柱）；作用于293T細(xì)胞時，TaI-LK15 （2：1）組轉(zhuǎn)染效率最高，細(xì)胞存活率為（91.0±3.7）%，Lipo（5：1）組轉(zhuǎn)染效率最高，細(xì)胞毒性也達(dá)到最大，細(xì)胞存活率為（77.8±4.1）%，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P

3 討論

脂質(zhì)體是目前使用最為廣泛的非病毒核酸轉(zhuǎn)染試劑，具有轉(zhuǎn)染效率高、可攜帶基因片段大、無免疫原性、可重復(fù)轉(zhuǎn)染等優(yōu)點。盡管如此，其細(xì)胞毒性和在體實驗組織損傷卻限制了其進(jìn)一步應(yīng)用，開發(fā)更有效、毒性更小、不干擾細(xì)胞生理活動的非脂質(zhì)體載體已成當(dāng)務(wù)之急。

細(xì)胞穿透肽是一類具有穿透細(xì)胞膜功能的小分子多肽，可有效介導(dǎo)比其分子質(zhì)量大近100倍的外源性疏水大分子（蛋白、核酸等）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而示見其對宿主細(xì)胞有明顯毒副作用。HIV -Tat蛋白則是現(xiàn)今研究最廣泛的細(xì)胞穿透肽之一，其主要機制可能包括：通過脂質(zhì)層的被動轉(zhuǎn)運，Tat上大量堿性氨基酸攜帶的正電荷與細(xì)胞表面的負(fù)電荷通過靜電作用轉(zhuǎn)運物質(zhì)；網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞；巨吞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞等。Tat蛋白結(jié)構(gòu)域堿性區(qū)中49～57位氨基酸（RKKRRQRRR），即蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域 （protein transduction domain， PTD）是HIV-Tat 蛋白中一個富含堿性氨基酸的具有穿膜活性的最小多肽片段。Nagahara和Schwarze等分別證實了Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域離體和在體條件下都具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。由于單純Tat介導(dǎo)核酸的轉(zhuǎn)染效率不甚理想，為優(yōu)化Tal轉(zhuǎn)染核酸的效率，Eguchi等通過結(jié)合一個雙鏈RNA結(jié)合域（doublestrand RNA binding domain，DRBD）構(gòu)成PTD-DRBD融合蛋白，后者可以包裹siRNA 上帶負(fù)電荷的骨架，避免其沉淀聚集，從而顯著改善了Tat對siRNA的轉(zhuǎn)染效率，甚至于脂質(zhì)。 Saleh和Arthanari等則指出，Tat經(jīng)LK15 （KLLKLLLKL-LLKLLK）修飾構(gòu)成的Tat-LKl5 可高效地介導(dǎo)基因傳遞，而細(xì)胞毒性在其濃度為10μmol/L時.即使用劑量的50倍才開始出現(xiàn)。因此Tat-LKl5可能是一種轉(zhuǎn)染效率高細(xì)胞毒性小的良好siRNA載體工具。

本研究顯示Tat-LK15/siRNA對293細(xì)胞和RGC-5細(xì)胞具有良好的轉(zhuǎn)染效率，雖然略低于Lipo，但最高轉(zhuǎn)染效率也可達(dá)（93.1±3.0）%和（87.3±4.5）%，表明Tat轉(zhuǎn)染效率較高且具有轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞的潛能，與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致。Tat-LKl5/siRNA（μg/μg）在1：2—4：3時，轉(zhuǎn)染效率顯著增高；而4：3組與 2：1組的轉(zhuǎn)染效率無明顯差異，表明在4：3時Tat-LKl5與siRNA交聯(lián)可能達(dá)到飽和Tat -LK15組細(xì)胞存活率最低分別為（91.0±3.7）%，和（90.0±6.1）%，未見明顯的細(xì)胞毒性，Lipo組siRNA轉(zhuǎn)染效率隨Lipo劑量增加而相應(yīng)增高，轉(zhuǎn)染效率可由40%升高至95%左右，而細(xì)胞毒性也顯著增強，細(xì)胞存活率由92%降至70%左右，由此可見，Tat-LKl5具有良好的核酸轉(zhuǎn)染效率，其生物安全性則表現(xiàn)得更為突出。

綜上所述，細(xì)胞穿透肽Tat-LK15具有良好的核酸轉(zhuǎn)染效率，且細(xì)胞毒性低，生物安全性好，是一種有一定應(yīng)用前景的非病毒核酸轉(zhuǎn)染載體，通過不斷改進(jìn)和優(yōu)化其轉(zhuǎn)染方法及條件，可用于轉(zhuǎn)染siRNA沉默目的基因的相關(guān)研究。本實驗結(jié)果為后期應(yīng)用Tat-LK15介導(dǎo)基因治療提供了理論依據(jù)。