灰花紋鵝膏茵（Amanita fuliginea）子實體發育及核相觀察

郝小花 田連福 楊 校 譚 虹 張志光 李東屏

摘 要：采用石蠟切片、壓片等方法對灰花紋鵝膏菌（Amanita fuliginea）子實體發育過程進行了觀察，并用核熒光染料Hoechst 33258對灰花紋鵝膏菌子實體發育過程中的核相變化進行了觀察。結果表明，灰花紋鵝膏菌子實體發育是典型的半被果型發育，菌褶是子實層同時發育類型，屬于同型菌髓。在于實體發育過程，單倍的二核擔子核配后形成短暫的二倍體單核擔子，經過減數分裂形成四核擔子，有近40%的擔子中核再進行一次有絲分裂形成8核擔子，擔子進一步發育產生擔孢子，其中，二核擔孢子約占95%，單核擔孢子約2.4%，三核孢子2%左右，4核擔孢子約0.4%。灰花紋鵝膏菌基因組中染色體數目2n=10條。

關鍵詞：灰花紋鵝膏菌；子實體；核相：染色體

中圖分類號：Q942.4

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）06-05ll-05

灰花紋鵝膏菌（Amanita fuliginea Hongo）是一種劇毒蘑菇，近年來在我國南方地區發生了數十起誤食該菌引起的中毒事件，中毒人數352人，其中死亡 79。其所含的鵝膏肽類毒素是致死毒素，同時該毒素足生命科學研究中重要的試劑，在抗腫瘤等牛物醫學領域也有潛在的用途。我們在對其所產牛的毒素、毒理及中毒治療等進行研究的同時，亦在生理生態、細胞發育等進行研究。鵝膏菌類真菌，由于不能人工栽培，取材困難，因此，其發育過程的研究極少有報道。而且，灰花紋鵝膏菌像大多數其他擔子菌一樣，染色體很小，難于用一般的染色方法進行核相和染色體數日觀察。以往一股采用繁瑣的蘇木精或吉姆薩染色法，重現性較差，且研究的種類也主要見于易于培養和取材的擔子菌，如草菇、平茹、香菇、鬼傘等。本文采用石蠟切片和熒光染色方法，對灰花紋鵝膏菌子實體發育及擔子減數分裂過程中核相變化進行觀察，該研究為進一步閘明灰花紋鵝膏菌的發育機制，進而為實現灰花紋鵝膏菌的人工栽培提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

灰花紋鵝膏菌（Amanita fuliginea）菌絲體、不同發育階段的子實體采集于湖南省長沙縣。卡諾氏固定液、熒光染料Hoechst 33258 （Bisbenzimide，Sigma，美國）、磷酸緩沖液（pH 6.8）。

1.2 方法

子實體的發育觀察采用石臘制片方法，橫切或縱切.切片厚度5μm。

擔子核相觀察采用熒光染色法。將子實體少許置載玻片上，用攝子搗碎，滴一滴染液，混勻，蓋好蓋玻片，靜置10 min，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 灰花紋鵝膏茵子實體的發育觀察

土壤中灰花紋鵝膏菌的營養菌絲發育到一定階段后，某些部位的菌絲會產生分化，向心生成直徑0.5 mm左右的白色菌球，結構上較疏松，由直徑3～4 μm的菌絲體扭結而成，內外菌絲形態上無甚變化（圖1A、C、F），但菌球中心點細胞是分裂活性中心。繼續發育至直徑lmm左右的菌球時，內外層菌絲體形態上開始出現分化。在菌球中心處產生結構致密的球狀原基。該群細胞較細短，因相互擠壓而使菌絲細胞變得有些彎曲，其內原生質濃，核熒光顯色顯示細胞核分裂旺盛（圖ID、G）。外層的菌絲細胞略粗，排列較疏松，核相清晰，菌絲問夾雜少量膨大的菌絲細胞球，組成原始外菌幕（圖1D）。隨著球狀原基內層細胞不斷分裂增多，其外圍細胞也不斷生長膨大，形成另一層由球形細胞和菌絲細胞組成的中層，愈是向外.其球形細胞的比例愈高，體積愈大，最后發育成外菌幕（圖1E），原始外菌幕在菌體發育中被撕毀。而球狀原基內層細胞的不等分裂，逐步發育分化出蓋原基和柄原基（圖1E、H）。蓋原基進一步發育出現菌肉原基，子實層體原基和蓋表皮原基以及內菌幕，隨后在子實層體原基中開始形成子實層，子實層出現前無菌褶腔形成，子實層體原基長出側生菌絲，幾次近端分叉，末端細胞即為原擔子，大量原擔子緊密而規則地排成層即構成子實層（圖1J～K）。子實層是同時發育類型。其褶緣囊狀體是假囊狀體，是與子實層原基同一來源的菌髓末端細胞膨大，液泡化的結果。子實層上無側緣囊狀體。隨著子實層的發育及菌蓋的膨大，菌柄也逐漸加粗伸長。在菌蓋展開菌柄伸長中，外菌幕被撕開殘留于菌柄基部一起構成菌托，內菌幕發育成菌環（圖1B），菌環由兩種排列方向的菌絲細胞組成，靠菌褶的一層菌絲體來源于褶緣不育菌絲，靠近菌柄的一層菌絲體來源于內菌幕。

2.2 子實體發育過程中核相變化及染色體數目觀察

灰花紋鵝膏子實體發育過程中，只有擔子發生減數分裂，像大多數擔子菌一樣，由二核擔子（圖2A）的兩個單倍性的核發生核配，融合為一個二倍性核的單核擔子（圖1B），緊接著發生減數分裂變為單倍性的四核擔子（圖2C）。約有40%的擔子為8核（圖2D～EI），是四核擔子再進行一次有絲分裂所致。但也有少量5核～7核擔子；擔子發育的過程中，會在頂端產生4個擔孢子，擔子中的核會遷移到擔孢子中。95%以上的扭孢子為二核（圖2F），少數擔孢子為單核和三核孢子（圖2G～H），偶見四核擔孢子（圖2I）（表1）。二核單孢子產生一方面是8核擔子中8核進入4個擔孢子.每個擔孢子二核；另一方面是因為4個單核孢子產生后，在小梗上各進行了一次有絲分裂所致。而單核、三核和四核擔孢子，是由于8核擔子在進入擔孢子中的少數出錯行為。

擔子在減數分裂過程中染色體排列呈現典型“土星環”結構（圖2K—N）。圖2J為減數第一次分裂的粗線期前后；圖2K為單土星環的結構；圖2L示減數分裂中后期兩組姊妹染色單體成環狀呈一定角度分離；圖M示減數分裂后期分開的兩組染色單體在擔子中呈雙環結構；圖2N、Nl示擔子減數分裂至終變期，兩組二價染色單體，n=5。因此，灰花紋鵝膏基因組中二倍體染色體數目為10條。

擔子減數分裂發生頻率與其發育階段有密切聯系。由表2可以看出，菌球期的擔子主要為核配前擔子（88.2%），剩下11.8%為已發生核配的擔子；發育到伸長期菌球破裂階段，則大部分擔子停留在核配期（53.9%），少部分已到減數分裂期（6.5%）；而到伸長期菌球半開階段，各種類型的擔子都可以觀察到，其中57%的擔子處在減數分裂期，便于進行分裂相和染色體數目觀察。至菌蓋平展的成熟期，部分擔子已產生擔孢子，核已遷移到擔孢子中。在菌蓋邊卜卷成熟期，絕大部分的擔子都已發生擔孢子。因此，要觀察灰花紋鵝膏菌擔子的核相和核分裂相，選擇菌球半開的伸長期的子實體為材料比較適宜。

3 討論

擔子菌個體發育的形式十分多樣，正確認識其子實體生長發育形成過程，對于分種及屬內系統分類有重要意義。鵝膏菌屬真菌的開裂子實層發育方式（schizohymenium）在傘菌目中是獨一無二的，其子實層及子實體的具體發育過程至今尚無確切的結果。Corner （1994）認為本屬真菌子實層體的形成方式與其他傘菌相同，即菌褶的形成是通過離心隆起（centrifugae ridges）實現的，隆起的下端（褶緣）是分生中心，楊祝良（1995）對毒蠅鵝膏（A.muscaria）和變紅鵝膏（A.rubescens）的個體做了顯微觀察，認為褶緣并非子實層分生區。他認為子實層發生有先后之分，它在子實層原基中相隔一定距離不同點啟動后向菌內或相反方向推進，之后連成褶片。而我們對子實體進行連續切片觀察表明，灰花紋鵝膏子實層的發生無明顯先后之分，褶緣細胞并不形成擔子，它們是與菌柄菌幕同一起源的菌髓細胞膨大形成；其附近的子實層也不是分生中心。菌褶的形成很可能亦不是離心隆起方式實現的；因為剛分化出菌褶原基時，菌髓細胞與菌肉細胞和菌柄細胞是緊密相聯的細長菌絲體，結構上無顯著差異，隨著蓋原基的發育，菌髓菌絲細胞逐漸與菌肉細胞及菌柄菌幕細胞垂直，由于菌絲細胞分裂變長的速度快于變粗的速度，菌肉組織的橫向增長快于子實層體原基的增粗，因此出現菌褶腔。輻射狀排列的菌褶形成依賴于基因時序表達的精確調控。

灰花紋鵝膏菌擔子發育，一般形成4個二核擔孢子。觀察灰花紋鵝膏菌的擔孢子，絕大多數為二核擔孢子，應是灰花紋鵝膏菌正常發育的擔孢子類型；在灰花紋鵝膏菌擔孢子發生過程中，也有極少數為單核、三核或四核擔孢子，不是灰花紋鵝膏菌正常發育的擔孢子類型，它們的產生，可能是擔子中的細胞核在向擔孢子遷移的過程中出錯所致。通過對分離培養的灰花紋鵝膏菌菌絲體的觀察，未發現鎖狀聯合之類的特征性結構，推測其產生的二核擔孢子為同核孢子。但遺憾的是目前尚不能人工培養出灰花紋鵝膏菌子實體，不能對二核擔孢子的交配類型進行驗證。

熒光染料Hoechst 33258能特異性地與核DNA結合，因此排除了常規染色法如蘇木精或吉姆薩（Giemsa）染液染色中對中心粒及核仁染色的干擾，重現性好，且通過熒光信號進行檢測，可以觀察到在細胞中保持自然狀態的核或染色體，是研究真菌減數分裂等核行為及觀察染色體數目的有效試劑。在灰花紋鵝膏菌菌絲體和擔子中，有絲分裂和減數第一次分裂時期都能觀察到染色體排列成環狀，而且還觀察到擔子中第一次減數分裂形兩個“上星環”后，第2次減數分裂隨即發生，呈現一個擔子中4個“土星環”的結構。通過熒光染色方法，觀察到灰花紋鵝膏菌基因組染色體數目為10條。