CAT為報告基因的銅綠假單胞菌啟動子文庫的建立及初步鑒定

馮夢蝶 洪 愉 許澤仰 毛普加 馮 金 趙繼華 楊洪文 宋武戰 黃 芬 井申榮 曾韋錕

摘 要：以CAT（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）為報告基因，構建pCAT2啟動子探針我體從綠膿桿菌基因文庫中篩選啟動子。Sau3A l酶切銅綠假單胞菌的基因組，回收（500—1 500bp）片段并與pCAT2載體連接構建銅綠假單胞菌的基因組文庫，PCR鑒定文庫的多樣性，利用氦霉素（1 0μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）雙抗平板篩選了l6株陽性菌株，并用PCR、測序、NCBI比對進行鑒定。構建的基因文厙的厙容鼉可達50 000個，覆蓋基因全長的3.5倍，插入率達90%，具有較強的隨機性。采用雙抗平板進行啟動子的篩選，篩選效率高達96%。獲得了綠膿桿菌基因組中的9個啟動子，同源性達99%以上，并對其活性進行初步鑒定，為銅綠假單胞菌基因表達調控的進一步研究奠定基礎。

關鍵詞：氯霉素乙酰轉移酶（CAT）；報告基因；銅綠假單胞菌（PA）；啟動子文厙

中圖分類號：R37

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）06-0521-06

氯霉素乙酰轉移酶（Chloramphenicol acetyl-transferase，CAT）是一種原核酶類，含有CAT的細菌暴露在氯霉素中可以使其乙酰化而失去活性，這是某些細菌抗氯霉素的主要原因，該酶能在大腸桿菌中表達，且非常穩定，是常用的報告基因之一。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruguzosa，PA）義名綠膿桿菌，是一種廣泛存在于自然界的革蘭氏陰性條件致病菌，當機體免疫機能低下時可引起多種感染。近年來，對人的致病作用明顯增加，是一系列嚴重的化膿性感染，尤其是支氣管擴張、慢性支氣管炎、囊性肺纖維化等疾病繼發感染的重要致病菌，是病人在住院期問感染的第3大致病菌。

細菌進入機體并生存下來需要一定的適應機制，其中涉及調控元件如啟動子、增強子、終止子等。而在這些調控元件中，啟動子是位于編碼基因上游與RNA聚合酶識別、結合的一段特殊DNA序列，起著“開關”的作用。因此，本研究以CAT為報告基因構建了一個缺乏啟動子的探針載體，構建綠膿桿菌基因組文庫從中“釣取”啟動子片段，并對啟動子的活性進行初步鑒定，為進一步研究銅綠假單胞菌的基因調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

感受態大腸桿菌DH5α，銅綠假單胞菌（ATCC27853），質粒pACYC184、pPhoA、pET -MR均為昆明理工的大學基因工程與制藥實驗室保存，pMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 工具酶和主要試劑

限制性內切酶（SalI、Xho I、S（LCI、BglⅡ）、DL DNAmarker2000、DL DNAmarker5000、T4 DNA連接酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。質粒DNA小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購白北京莊盟國際生物基因科技有限公司。RNaseA購白生工生物工程（上海）股份有限公司。蛋白酶K購自Fermentas（加拿大）公司。Taq DNA聚合酶I購白天根生化科技（北京）有限公司。LB培養基：酵母粉5 g.胰蛋白胨10 g，NaCl 10g，定容至l L（固體加2%的瓊脂）?？敲顾亍⒙让顾亍逼S青霉素、PCR試劑均購白生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CAT基因擴增

引物的設計：參考pACYC184載體中CAT序列設計引物，在引物上下游分別引入Nde I、Xho I酶切位點，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見表l。

目的片段的擴增：用引物1和引物2，以pA-CYC184質粒為模板，擴增CAT基因。PCR參數：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；50 ℃復性30 s、72 ℃延伸40 s，循環35次；72℃總延伸5min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，小量瓊脂糖凝膠試劑盒純化目的片段。T-A克隆至pMD18-T，獲得pMD18-T-CAT，用Nde I和Xho I雙酶切鑒定，并送華大基因測序。

1.2.2

pCAT2載體的構建

測序正確后，Nde I 、Xho I雙酶切pMD18T-CAT，回收小片段。pER-MR載體（圖1）用限制性內切酶Nde I和Xho I雙切，膠回收載體大片段二將兩者用T4 DNA連接酶連接，轉化E.coli DH5α，kan+抗性平板篩選。隨機挑選平板上長出的單個菌落接種于LB液體培養基過夜培養后提質粒，雙酶切鑒定。鑒定正確的載體命名為pCAT2。

1.2.3 銅綠假單胞菌基因組提取、酶切與回收

從-80 ℃冰箱中取出保存的銅綠假單胞菌，室溫融化后取50μL菌液加入到盛有5 mL LB液體培養基中，37℃過夜培養至對數生長期的中晚期時收獲細菌，提取細菌基因組DNA，具體過程如下：取5 mL銅綠假單胞菌12 000 r/min離心1min，沉淀用567 μL TE重懸，然后加入30 μL，10% SDS、3 μL 20 mg/mL蛋白酶K混勻，37 ℃溫育l h：再加80 μL 3mol/L CTAB/NaCl允分混勻，于65℃溫育10 min；加入等體積的氯仿/異戊醇混勻，l2 000 r/min離心10 min，將上清轉移至新的EP管中；再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12 000r/min離心10 min，將上清轉移至新的EP管巾；加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，有絮狀沉淀出現，12 000 r/min離心10 min，棄上清；沉淀用70%和無水乙醇各洗一次后晾干，用100 μL TE重懸、定量。用Sau3A I酶切銅綠假單胞菌基因組DNA，最佳條件的摸索如表2所示。在最佳酶切條件下大量酶切，1.5%瓊脂糖電泳回收500—1 500 bp的片段。

1.2.4銅綠假單胞菌基因組文庫的構建與鑒定

將含有質粒pCAT2的大腸桿菌DH5a接種于含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，按照質粒提取試劑盒提取質粒。pCAT2載體用BglⅡ酶切、去磷酸化，凝膠回收。采用T4 DNA連接酶將去磷酸化的載體與綠膿桿菌基因組隨機片段按摩爾比為1：5的比例16 ℃過夜連接，連接產物轉化到DH5α感受態中，涂布于Kan+抗性平板篩選，計數平板上的菌落。隨機挑選16個菌落，以引物2和引物3進行菌落PCR擴增DNA片段，鑒定插入片段的隨機性。PCR反應參數：94℃預變性15 min；94℃變性30 s；50℃復性30 s、72 ℃延伸90 s，循環35次；72 ℃總延伸I0 min。將PCR產物在含有溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像儀分析系統分析處理。

1.2.5 啟動子文庫的構建與篩選

收集上述平板上所有菌落于含有LB培養基的無菌EP管中，按質粒小量抽提試劑盒說明書提取質粒DNA，得到含銅綠假單胞菌基因組DNA隨機片段的質粒庫，即為啟動子文庫。然后將混合質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態，同時以沒有插入制綠假單胞菌基因組DNA隨機片段的空載體質粒為對照?？敲顾兀?0μg/mL）和氯霉素（10μg/mL）雙抗平板篩選具有啟動子活性的陽性菌株。

1.2.6 啟動子的鑒定

pCAT2重組質粒是缺失啟動子，如果在Bgl II位點插入的DNA片段具有有啟動子活性，則某些菌落能表達CAT因此能夠抗一定濃度的氯霉素。經過雙抗平板篩選的陽性單克隆，初步說明插入的DNA片段具有啟動子的功能。隨機挑選10個單菌分別接種于5 mL含有卡那霉素的LB液體培養基，37℃過夜振蕩培養，抽提質粒，PCR鑒定后，用引物2和引物3進行雙向測序，分析插入片段的平均長度，將測序結果上傳到Internet（http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST/）上與銅綠假單胞菌傘基岡組序列做Blast分析。

2 結果

2.1 PCR擴增CAT

pCAT2載體包含來自于pACYC184的CA71報告基因、pBR322的復制起始位點和卡那霉素抗性基因。CAT基因的PCR結果如圖2所示。PCR產物經T-A克隆至pMD18-T，經Nde I和Xho I雙切，因pMD18一T載體自身含有一個Nde I酶切位點，切出 3個片段：載體骨架、預期目的片段和小片段，切出片段的大小為678 bp，符合預期值（圖3）。測序結果經比塒與pACYC184的CAT序列完全一致。

2.2

pCAT2載體的鑒定

雙酶切后插入pER-MR 中構成pCAT2載體重組子經Nde、Xho I雙酶切后，得到兩個大小不同的片段，大片段人小5.2 kh，為載體片段，小片段為插入片段，大小均符合預期值（圖4），表明pCAT2載體構建成功。

2.3 銅綠假單胞菌基因組酶切條件的探索

為了獲得500～1 500 bp的銅綠假單胞菌基因組DNA隨機片段，用Sau3A I進行部分酶切時，需要調整酶量、反應時間以選擇最佳酶切反應條件。實驗摸索表明要獲得500～1 500 bp的DNA片段，最適酶濃度為0.2 U/μL，反應時間l h （圖5）。在此基礎上進行大量酶切，膠回收500—1 500 bp范圍的DNA片段。

2.4 啟動子文庫質量的鑒定

銅綠假單胞菌的基因組全長約為6.3 Mb，文庫獲得約50 000個克隆，捅入片段平均大?。?00 bp），質粒文庫大約覆蓋基因組全長的3.5倍（50 000x900 bp/6.3 Mb/2）。隨機挑取的16個陽性單克隆中，有14個克隆PCR產物含有插入片段，文庫插入率達到90%左右，PCR結果見圖6。隨機抽取10個含有插入片段質粒的PCR產物（引物為P2、P3），其中9個質粒插入片段平均長度為約900 bp（圖7）。將測序與銅綠假單胞菌基因組序列做Blast分析，結果9個片段與綠膿桿菌全基因組序列吻合，同源性99%以上，結果見表3。

3 討論

銅綠假單胞菌是病人在住院期問再次感染的主要病原菌之一。其中代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，以及術后或某些治療后的患者易感染本菌。經常導致術后傷口感染，也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可血行播散，發生菌血癥和敗血癥。燒傷后感染銅綠色假單胞菌嚴重者可死亡。

啟動了探針載體是分離和測定啟動子效率的主要工具，通常借助于易檢測的報告基因來完成。目前在細菌研究中常用的報告基因有抗性基因和非抗性基因。為了研究銅綠假單胞菌的基因表達和調控，本研究構建了pCAT2啟動子探針載體，在綠膿桿菌基因文庫中篩選啟動子，并成功獲得9種啟動子。

氯霉素乙?；D移酶可催化乙酰CoA的乙酰基轉移到氯霉素3羥基，而使氯霉素分解，從而使得宿主菌能住含有氯霉素的條件下生長。目前CAT廣泛應用于哺乳細胞瞬時性表達，也可進行蛋白質印跡和免疫組織化學等方面的分析。

本研究以CAT作為報告基因，將銅綠假單胞菌基因文庫構建到pCAT2載體上，使基因文庫隨機插入，在沒有DNA片段插入時，CAT是不能表達的，只有在CAT前插入啟動子，才能使其表達表現出抗氯霉素的特性。實驗中利用雙抗篩選出能夠生長的陽性單菌，說明有銅綠假單胞菌啟動子的插入，并能使CAT表達，表現出抗氯霉素的特性，初步說明插入的DNA片段具有肩動子活性。

文庫的容量是衡量文庫的質量的重要標準按照公式N=ln（l—P）/ln（1-f），其中N是轉化成功的單克隆數，P是覆蓋率，f是插入片段大小與其因組DNA大小的比值。銅綠假單胞菌基因組隨機片段的平均人小約為900 bp，銅綠假單胞菌標準菌株的基因組全長約為6.3 Mb，若要求插入DNA片段在文庫中出現的概率為99%，所需轉化成功的菌落數約為32 227個，我們總共獲得約50 000個克隆，我們構建的文庫約覆蓋基因的3.5 倍，并且90%左右還有隨機插入片段，表明文庫質量較好

本研究使用CAT作為篩選標記，用雙抗來篩選.效率高達96%，從而簡化了篩選過程，工作量也大幅度下降。從理論上說，文庫菌在雙抗平板上長出的單克隆則表明插入片段含有啟動子。我們挑取9個進行測序分析，對應插入基因信息如表3所示，其中3～8號分別包含核酸外切酶、未知功能DUF1654蛋白、蛋氨酸亞砜還原酶B、谷胱甘肽過氧化物酶、3-氧代?；?ACP還原酶，且插入方向與報告基因CAT方向一致，這與預期相符。其他4個插入片段的插入方向與CAT的方向相反。反復實驗證實這些菌落在雙抗平板上能夠生長，甚至氯霉素的濃度為34μg/mL時仍能正常生長，因此我們推測這些插入片段中可能含有未被發現或注釋的強組成型肩動子，這有待下一步驗證。

綜上所述，本文以pCAT2為啟動子探針載體，構建了銅綠假單胞菌的隨機啟動子文庫，在初步實驗的基礎上為下一步深入研究銅綠假單胞菌基因功能與調控以及致病性等研究奠定了良好基礎。