基于ISSR分子標記的海南鳳仙花種群遺傳多樣性

鐘云芳等

摘 要 運用ISSR分子標記技術，分析海南島石灰巖地區海南鳳仙花自然種群的遺傳結構，比較3個海拔梯度對種群遺傳結構的影響。結果顯示，13個ISSR引物的擴增結果顯示其多態性位點百分率為97.7%。AMOVA分析表明：海南鳳仙花自然種群的變異主要來自種群內（92%），而種群間變異較少（8%）；中海拔種群的遺傳多樣性最為豐富；而高海拔種群的遺傳多樣性則較低；種群的遺傳距離和地理距離表現出顯著的高度相關性。說明海拔是影響種群基因流的重要因素，高海拔種群可以向中低海拔種群進行傳播花粉和種子等基因流動，而中低海拔種群向高海拔種群進行類似的基因流動則較為困難，海南鳳仙花數量較少的主要原因可能來自于其生境的限制。因此在以后的保護工作中要特別注重其生境的保護，避免人為因素的破壞。

關鍵詞 海南鳳仙花；遺傳標記；海拔梯度；瀕危機制

中圖分類號 Q948.12.2 文獻標識碼 A

ISSR Analysis on Population Genetic Diversity of Impatiens hainanensis Balsaminaceae， an Endemic

Species to Hainan Island

ZHONG Yunfang1，3， HU Xiangyu1，2， SONG Xiqiang1，2， ZHOU Zhaode1，3 *

1 Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources（Hainan University），

Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

2 College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Impatiens hainanensis is endemic to Hainan Island. Its number of plants is very low and habitat is easily damaged. This research used the ISSR molecular marker technology to analysis the genetic diversity of Impatiens hainanensis population and compared the effects of three elevation gradients on population genetic structure. The results indicated that： 13 ISSR primers amplification results showed that the polymorphism loci percentage is 97.7%； AMOVA analysis indicated that the variation of Impatiens hainanensis population occurred mainly within populations（92%）and limitedly between populations（8%）； Altitude populations in the most abundant genetic diversity； The high altitude population genetic diversity is low； genetic distance and geographic distance of population showed a significantly high specificity. Analysis shows that altitude is the important factors that affect the population gene flow， high altitude populations can be spread pollen and seeds to the low altitude populations， the similar activity from low altitude populations to high altitude populations is more difficult， the main reason for the small number of Impatiens hainanensis plants came from its habitat. So in the future for protection work， we should put special emphasis on the habitat protection and avoid the destruction of the human factors.

Key words Impatiens hainanensis； Genetic markers； Altitude gradient； Endangered mechanism

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.001

遺傳多樣性是生物多樣性的核心，保護生物多樣性最終是要保護遺傳多樣性[1]。通常，遺傳多樣性最直接的表現形式就是遺傳變異水平的高低。對任何一個物種來說，個體的生命很短暫，由個體構成的且在時間上連續不斷的種群或種群系統（宗、亞種、種），才是進化的基本單位[2-3]。對于種群內或者種群間以及種內或者種間遺傳多樣性的鑒定和評估，分子標記已經被證明是一種較好的方法[4]，不同變異的級別需要不同的分子標記方法[5-6]。ISSR （Inter-Simple Sequence Repeat）分子標記，又稱簡單重復序列區間，其原理是利用真核生物基因組內廣泛存在的簡單重復序列，設計單一通用引物對基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物經較高濃度的瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯酰胺凝膠電泳分離獲得擴增指紋圖，從而可以揭示樣本間的遺傳多樣性[7-8]。ISSR技術克服了RAPD（random amplified polymorphic DNA）的低再現性、AFLP（amplified fragment length polymorphism）的高耗費以及SSR（Simple Sequence Repeat）必須知道兩側基因序列等因素的限制[9]。此外其高度多態性以及快速性等特點[10-12]無疑為其在高等植物研究中提供了廣闊的應用前景[10]。近年來，ISSR分子標記技術廣泛應用于包括遺傳多樣性、系統發生學以及進化生物學等研究[13]。何俊等[14]通過ISSR技術對多葉重樓3個變種共8個居群進行了遺傳多樣性分析，結果表明，各個居群的遺傳多樣性較高，滇重樓與狹葉重樓有較近的親緣關系；曹國艷[15]使用ISSR分子標記進行木蘭科含笑屬及其相關屬的系統發育分析，結果顯示，木蓮屬和木蘭屬的皺種組與天女木蘭組親緣關系較近，建議重新界定木蘭屬范圍，并成立玉蘭屬，建議將合果木屬歸入含笑屬，建議取消含笑屬下亞屬和組的劃分，設為含笑屬；龔漢雨等[16]使用31個ISSR引物對山羊草屬Aegilops多倍體植物及其祖先二倍體的基因組進行了分析，結果表明，與其二倍體祖先種相比，異源多倍體物種的基因組發生了很大變化。

海南鳳仙花（Impatiens hainanensis Y. L. Chen）是海南特有植物，主要分布在海南昌江縣、東方市等地區的石灰巖山頂，多見于裸露石灰巖縫隙[17]。近年來由于人類活動的影響，海南鳳仙花的種群數量和分布面積呈減少趨勢，再加上島嶼特有種本身分布范圍的局限、生境脆弱且種群數量較少，更易于瀕危或滅絕[18-19]，海南鳳仙花已被列為海南省級重點保護植物[20]。本研究采用ISSR分子標記技術，研究海南鳳仙花的種群遺傳多樣性水平以及數量稀缺的主要原因，海拔高度以及地理距離對于海南鳳仙花種群遺傳多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料采集與處理

研究區域為海南省昌江黎族自治縣王下鄉和東方市江邊鄉峨賢嶺地區（圖1所示為海南鳳仙花種群區位），記錄海南鳳仙花自然種群分布的經緯度、海拔和生境（表1）。實驗材料為海南鳳仙花（I. hainanensis）葉片，每個種群采集14～30個植株，平均采樣，以每個植株的2～3個葉片為一個樣本，采集后立即放入盛有干燥硅膠的封口袋內，每隔3～5 h翻動硅膠，確保24 h內干燥完全。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及純度檢測 采集后的葉片用液氮研磨，并用CTAB法進行提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質量，電壓120 V電泳30 min。紫外分光光度計法計算所得DNA的濃度和純度。

1.2.2 ISSR-PCR擴增體系 采用20 μL擴增體系：DNA 25 ng，Taq酶1 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Primer 1.0 μmol/L。擴增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產物使用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 ISSR-PCR引物篩選 以加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100套引物進行篩選（Http：//www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers/Primers.pdf）。每個種群選擇3個模板，篩選出13條擴增條帶較多、信號強、背景清晰的引物（表2）。

1.3 數據的統計與分析

13條引物對各個居群進行擴增之后，采用人工讀帶，根據條帶的遷移率和有無記錄二元數據，有帶記為1，無帶記為0。排除模糊不清的帶和無法準確標識的帶。用POPGENE 1.32軟件計算種群遺傳多樣性和遺傳分化等指數，并用UPGMA進行聚類分析。應用GenAlEx 6.41（Genetic Analysis in Excel）軟件對種群內和種群間的遺傳變異進行分子變異分析（AMOVA）。

2 結果與分析

2.1 種群遺傳多樣性分析

13條引物對來自不同地點的種群共計182個樣本DNA進行擴增，共擴增出87個位點，其中多態性位點85個（表2），多態性位點百分率（P）為97.7%。

高海拔種群的Neis基因多樣性（He）數值在0.291 0～0.378 1之間，平均值為0.323 5，而中低海拔的種群的Neis基因多樣性（He）數值在0.388 5～0.395 8之間，平均值為0.391 3，最大值與最小值分別出現在Pop4（0.395 8）和Pop2（0.291 0）（表3），高海拔種群和低海拔種群的Neis基因多樣性（He）差異顯著。

與Neis基因多樣性（He）相似，高海拔種群的Shannon信息指數（Ho）數值在0.439 0～0.558 4之間，平均值為0.489 4，而中低海拔種群的Shannon信息指數（Ho）數值在0.571 4～0.578 4之間，平均值為0.573 1，最大值和最小值同樣出現在Pop4（0.578 4）和Pop1（0.439 0）（表3），高海拔種群和低海拔種群的Shannon信息指數（Ho）差異顯著。

2.2 種群遺傳結構

2.2.1 種群遺傳分化 遺傳變異主要發生在種群內部。種群總基因多樣度（Ht）為0.422 2，其中種群內的基因多樣度（Hs）為0.366 8；種群間的遺傳分化系數（Gst）為0.131 1，即86.9%遺傳分化發生在種群內部；而13.1%的遺傳分化發生在種群間，表明種群間具有一定水平的遺傳分化，大部分的遺傳變異主要發生在種群內部（表4）。AMOVA分析表明，種群內部和種群間均存在顯著的遺傳分化（P=0.010），種群間遺傳變異占總遺傳變異的8%，種群內占92%（表5）。上述結果與POPGENE分析基本一致。

2.2.2 基于遺傳一致度的聚類分析 根據Nei的方法，計算Nei遺傳距離及遺傳一致度。采樣區域的海南鳳仙花自然種群之間的遺傳距離變化范圍為0.004 6～0.221 7之間（表6），平均遺傳距離為0.122 1。從UPGMA聚類法得到的遺傳關系圖（圖2）可看出，pop1種群和pop2種群聚類在一起，pop6種群和pop7種群聚類在一起；pop3種群遺傳關系與其他6個種群遺傳距離最遠。

2.2.3 遺傳距離與地理距離的相關性分析 根據種群經緯度在谷歌地球中測量2個種群之間的位置（表7），海南鳳仙花自然種群之間的遺傳距離和地理距離呈現顯著的高度相關性，相關系數r=0.952（p<0.01），暗示著地理距離可能是限制海南鳳仙花自然種群間基因流動的重要因素。

3 討論與結論

3.1 海南鳳仙花的遺傳多樣性

海南鳳仙花種群的多態性位點百分率高達97.7%，遠遠超過雙子葉植物平均值44.8%，由此可知，海南鳳仙花種群具有較高的遺傳多樣性水平[21]。海南鳳仙花自然種群中低海拔的遺傳多樣性遠遠高于高海拔梯度的種群（表3），這一結果與北京東靈山柴胡在中低海拔種群的遺傳變異高于高海拔種群一致，可能是由于隨著海拔升高，光照、溫度和水分等環境因素變化所致[22]。這種有限地理范圍內的種群變異主要來自于生境選擇壓力[23-24]。海南鳳仙花高海拔種群生境較為單一，環境趨于極端，相應的其群落組成也較為單一；而中低海拔種群的生境異質性高，其植物群落組成較復雜，選擇壓力大，因此也就表現出較高的變異。不同海拔種群變異不同的原因一方面可能是環境因子的變化導致，另一方面可能是因為低海拔地區向高海拔地區的基因流動較為困難，其基因流限制在相似海拔高度的種群，而高海拔地區向低海拔地區的基因流則較為容易[25]。

3.2 海南鳳仙花的遺傳結構

種群間分化與環境因子的選擇和基因流的阻隔有關，生態小環境的變異可導致不同種群間在遺傳結構上的顯著差異[26]。種群間變異越大，該物種適應環境的能力越強[27]。海南鳳仙花種群的變異主要來自種群內（92%），而種群間變異較小（8%），說明海南鳳仙花種群的環境適應性較低。種群遺傳距離和地理距離之間的關系現在還沒有比較確切的定論。種群遺傳距離和地理距離在一些研究中表現為顯著的正相關關系[28-31]，但也有研究得到了相反的結論[32-34]。本研究結果表明，海南鳳仙花自然種群的遺傳距離和地理距離具有高度的相關性，這可能是因為花粉和種子的傳播受到了昆蟲飛行距離和種群生境片段化影響所致。海南鳳仙花種群海拔較高，種群之間由于地形的限制，從而出現了生境的片段化，而生境片段化的另一結果則是對昆蟲傳粉距離的限制，因此海南鳳仙花種群的地理距離可以在某一程度上反應其種群的遺傳距離。

3.3 海南鳳仙花瀕危機制及其資源保護

海南鳳仙花種群生境較為單一，種群間的變異較小，說明海南鳳仙花自然種群之間的基因流動較少。因此限制海南鳳仙花種群發展的重要原因來自于地形因素和其自身生境，具體表現為種群生境的片段化以及生境結構的單一性。針對海南鳳仙花種群植株較少這一現象，一方面要著重保護其棲息地和生境免受人為因素的破壞，進行就地保護，更好地保護其群體的遺傳特性。另一方面還可結合遷地保護和再引入，通過種群間人工授粉的方法提高其基因流，以促進其種群的發展。

致 謝 海南省霸王嶺國家自然保護區王進強助理工程師、海南大學園藝園林學院張哲和武華周同學參與了部分野外調查工作，特致謝忱！

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責任編輯：趙軍明