不同傷害性刺激致大鼠痛感覺與痛情緒的比較

汪偉偉 劉菊 蔣雪麗 張森 方博文 劉偉 黃宏平 汪萌芽

摘 要：為比較不同傷害性刺激致大鼠痛感覺與痛情緒的差異，對17只麻醉SD大鼠進(jìn)行痛感覺代表腦區(qū)異顆粒區(qū)（dysgranular zone，DZ）和痛情緒代表核團(tuán)基底外側(cè)杏仁核（basolateral amygdala，BLA）電活動，與心電、呼吸肌肌電、皮膚電導(dǎo)、體溫的同步心理生理學(xué)記錄，按順序均衡法分別給予熱、夾尾和電刺激觀察到熱和夾尾刺激增強(qiáng)BLA和DZ.而電刺激僅增強(qiáng)DZ的放電活動，且熱刺激所誘發(fā)的BLA與DZ放電活動均強(qiáng)于夾尾和電刺激所誘發(fā)的活動（P<0.05）。BLA與SZ的基礎(chǔ)放電頻率呈正相關(guān)（P<0.05），夾尾刺激后相關(guān)性增高（P

關(guān)鍵詞：傷害性刺激：痛感覺；痛情緒；異顆粒區(qū)（DZ）；基底外側(cè)杏仁核（BLA）

中圖分類號：R441.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）05-0411-07

世界衛(wèi)生組織將疼痛確定為繼血壓、呼吸、脈搏、體溫之后的“第五大生命體征”，但疼痛的心理生理學(xué)機(jī)制尚不清楚。1994年國際疼痛研究會（international assoCiation for the study pain， IASP）將疼痛定義為：“一種組織損傷或潛在損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺和情緒體驗”。此定義說明疼痛包括痛感覺和痛情緒兩方面。疼痛發(fā)生過程中既有痛感覺傳導(dǎo)通路又有痛情緒的傳導(dǎo)通路，以往在研究大鼠接受不同傷害性刺激時腦內(nèi)核團(tuán)的腦電活動變化存在相似和不同的爭議。究其原因可能還是各研究者在核團(tuán)及傷害性刺激種類選取上存在差異所致。在猴的研究中已表明傷害性刺激會特異性引起第一軀體感覺皮層中的3a區(qū)域發(fā)生反應(yīng)，在后續(xù)研究中又發(fā)現(xiàn)大鼠腦中異顆粒區(qū)（dysgranular zone，DZ）與猴腦中3a區(qū)域具有類似的功能，但不同傷害性刺激在大鼠DZ區(qū)域是否誘發(fā)差異性反應(yīng)，尚未見報道。已有文獻(xiàn)報道，痛情緒反應(yīng)過程中基底外側(cè)杏仁核（baso-lateral amygdala，BLA）起到非常重要的作用。另外，在人類情緒的心理生理學(xué)研究中也特別重視對情緒相關(guān)的自主性生理反應(yīng)的觀察，因為這些自主性生理變化和情緒之間存在著顯而易見的聯(lián)系。如研究表明，心率、皮膚電反應(yīng)、血壓等都是反映情緒變化的有效指標(biāo)。疼痛往往伴有抑郁情緒的發(fā)生，在有抑郁癥狀的患者中有大部分同時具有疼痛癥狀。同時神經(jīng)解剖學(xué)證明，很多參與疼痛形成的腦區(qū)，同時也參與自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。為此，利用心理生理學(xué)技術(shù)，給予大鼠不同傷害性刺激（熱刺激、夾尾刺激、電刺激），采集疼痛過程中的核團(tuán)放電、呼吸肌肌電、體溫、心電、皮膚電導(dǎo)等指標(biāo)來反映疼痛過程中的痛感覺和痛情緒的發(fā)生過程，觀察和比較痛情緒代表核團(tuán)BLA和痛感覺代表核團(tuán)DZ的放電活動及其相關(guān)性，以及各項外周生理指標(biāo)變化的異同。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用250—300 g成年SD雄性大鼠17只，由南京青龍山動物繁殖場提供。

1.2 儀器設(shè)備及藥品

常規(guī)動物手術(shù)器械如血管鉗式夾尾儀、電針、溫度計，雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽罩和防震臺，腦立體定位儀（上海奧爾科特生物科技有限公司）、手術(shù)顯微鏡、牙科鉆和保溫毯。不銹鋼同芯金屬電極、金屬參考電極和微電極放大器，PowerLab八通道生理信號采集與處理系統(tǒng)（PowerLab System，AD Instruments，Australia）及其Chart Pro記錄和分析軟件，20%氨基甲酸乙酯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、75%醫(yī)用酒精（德州安捷高科消毒制品有限公司）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物麻醉

術(shù)前晚給實驗大鼠禁水禁食處理，1.5 mL/kg20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉穩(wěn)定后將大鼠固定于腦立體定位儀，下墊恒溫37.O℃保溫毯，放置在雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽罩內(nèi)的防震臺上。

1.3.2 多項生理指標(biāo)記錄

將針式電極插入大鼠右前肢腕關(guān)節(jié)上部的前臂皮下，左后肢踝關(guān)節(jié)上部的小腿皮下，右后肢接地，記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。在大鼠肛門內(nèi)放置體溫?fù)Q能器探頭并用醫(yī)用膠布同定，進(jìn)行體溫信號采集。以2根針式電極插人大鼠右側(cè)腋中線第9肋下緣肋間外肌內(nèi)，記錄呼吸肌肌電圖。將兩塊板式皮膚電導(dǎo)電極，用醫(yī)用膠布分別固定于大鼠左前掌背面和腹面，記錄皮膚電導(dǎo)信號。

1.3.3 腦部雙核團(tuán)細(xì)胞外記錄

調(diào)節(jié)耳桿使左右對稱，上下移動門齒桿使大鼠顱骨處于同一水平面，固定大鼠頭部使之不能移動。用手術(shù)刀切開頭皮，3%H202擦拭充分止血，暴露顱骨標(biāo)志（前囟、人字縫）。調(diào)節(jié)前囟、人字縫到同一水平平面。定位：異顆粒區(qū)（DZ）：前囟后（AP），0.48—-3.3 mm；旁開（L），3.5～4.6 mm；硬膜表面以下（DV），0.8—3.0 mm；基底外側(cè)杏仁核（BLA）：前囟后（AP），-1.56—-3.36 mm；旁開（R），3.9～4.6mm；硬膜表面以下（DV），7.8—8.82 mm。用牙科鉆鉆顱開窗，手術(shù)顯微鏡下用顯微剪剪開硬腦膜、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜，3% H202充分止血。使用金屬電極在操作臂的牽引下移至顱窗上，并緊貼腦組織，2%生理鹽水瓊脂封窗。安置好參考電極、接地電極。記錄電極接人記錄放大系統(tǒng)。操縱電極下至目標(biāo)腦區(qū)后，尋找合適、明確的細(xì)胞外放電信號，待BLA、DZ及各項生理指標(biāo)信號穩(wěn)定后，記錄基礎(chǔ)數(shù)據(jù)20 min并存盤。

1.3.4 傷害性刺激

熱刺激：將大鼠尾部8—10 cm放入50 ℃水中，3s后取出尾部，持續(xù)觀察并作記錄。夾尾刺激：使用充分絕緣后的血管鉗夾持大鼠尾巴后1/3處，以后肢抽動為適宜強(qiáng)度，5s后撤離刺激，持續(xù)觀察并記錄。電刺激：將刺激電極插入大鼠尾巴后1/3處，給予9 Hz， 200卜μs，5 mA恒流刺激，持續(xù)觀察并記錄。采用排列組合的方法進(jìn)行刺激順序均衡，安排給予同一大鼠的不同傷害性刺激。刺順序有6幣種方案：HTE、HET、THE、TEH、E—HT、ETH （H： Thermal stimulus；T：Tailpinch；E：Electrical stimulation）。各大鼠隨機(jī)按其中一組刺激方案進(jìn)行實驗，每種刺激記錄刺激前20 min到刺激后40 min的信號。

1.3.5 信號采集參數(shù)設(shè)置

記錄電極所引導(dǎo)和記錄的信號經(jīng)放大器，進(jìn)入PowerLab多導(dǎo)生理信號采集與處理系統(tǒng)，由計算機(jī)中Chart軟件進(jìn)行采集、存盤，采樣頻率10 kHZ，各通道參數(shù)設(shè)置如下：BLA、DZ腦電信號高通10 Hz、低通2 kHz.體湍信號低通10 Hz，心電信號高通10 Hz、低通200 Hz，呼吸肌肌電信號高通0.1 Hz、低通200 Hz，皮膚電導(dǎo)信號量程設(shè)為l0μS。

1.3.6 記錄位點鑒定

實驗結(jié)束，斷頭處死大鼠并取腦，置于4%甲醛溶液內(nèi)固定后做冠狀而切片，觀察針道位置與圖譜BLA、DZ的位置進(jìn)行比對，進(jìn)行記錄位點鑒定。

1.4

數(shù)據(jù)分析

I.4.1 記錄信號的分析

記錄到的腦內(nèi)核團(tuán)放電活動信號、各項生理指標(biāo)信號，分別使用Charl Pro系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)測量和分析。分析細(xì)胞外記錄的核團(tuán)電活動的放電頻率直方圖反映核團(tuán)電活動的頻率及其放電活動的特點。幅值為選定時問的每2 s內(nèi)信號幅度最大值減去最小值的平均值。呼吸肌肌電周期計算，使用Chart Pro軟件中周期測量（cyclic mea-suUrements）功能，濾波設(shè)為高通150 Hz、最小周期與最小峰高S.D.按數(shù)據(jù)模擬的準(zhǔn)確程度適當(dāng)調(diào)整，將數(shù)據(jù)添加到數(shù)據(jù)板，可自動算出均數(shù)，即為平均肌電周期或用直接計數(shù)法進(jìn)行統(tǒng)計。

1.4.2 統(tǒng)計學(xué)分析

各數(shù)據(jù)結(jié)果均以x±s表示，兩組均數(shù)差異的比較用t檢驗，多組均數(shù)差異的比較用單因素方差分析，相關(guān)性分析用直線相關(guān)和直線回歸分析。P<0.05為差異有顯著性意義。

2

結(jié)果

2.1 腦內(nèi)BLA、DZ電活動和多項生理指標(biāo)同步記錄

典的痛情緒、痛感覺反應(yīng)代表核團(tuán)BLA、DZ放電信號和心電、體溫、呼吸肌肌電、皮膚電導(dǎo)等各項生理指標(biāo)穩(wěn)定記錄例示于圖1。各信號均穩(wěn)定的13只大鼠前20 min正常六通道記錄數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)分析顯示.其BLA和DZ核團(tuán)相關(guān)性r=0.646，P=0.017，表明兩核團(tuán)放電頻率呈正相關(guān)。基礎(chǔ)記錄20 min的BLA腦電幅值（295.26+78.50）μV、DZ腦電幅值（143.61±52.65）μV、體溫（37.11±0.67）℃、皮膚電導(dǎo)（0.20+0.18）μS、心率（361.28±24.71） bpm、R波幅度（422.80±145.27）μV、呼吸肌電幅值（81.04±31.52） μV、呼吸肌電平均周期（0.91+0.05）s，與前期報道文章相似。

2.2

熱刺激誘發(fā)的反應(yīng)

2.2.1 熱刺激對BLA、DZ電活動的影響

對17只給予熱刺激實驗的大鼠進(jìn)行BLA、DZ放電頻率直方圖分析，結(jié)果顯示其中有10只大鼠在刺激后有BLA、DZ放電頻率增高反應(yīng)，典型結(jié)果例示于圖2，其余大鼠未誘發(fā)出此類現(xiàn)象，對此10只大鼠的熱刺激前2 min、熱刺激引起的峰反應(yīng)時、峰反應(yīng)后2min的BLA放電頻率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析（圖2A），可以看到反應(yīng)時BLA放電頻率相對刺激前有顯著性增加（P<0.01），反應(yīng)后相對反應(yīng)時放電頻率恢復(fù)（P<0.01）。同樣對DZ腦電進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，圖2B顯示反應(yīng)時DZ放電頻率棚對刺激前有顯著性增加（P

2.2.2 熱刺激對各生理指標(biāo)的影響

分析此10只大鼠在熱刺激前、刺激時、刺激后呼吸肌肌電頻率，結(jié)果顯示刺激時較刺激前人鼠呼吸頻率增快（圖3A，P0.05）。

2.3 夾尾刺激誘發(fā)的反應(yīng)

2.3.1 夾尾刺激對BLA、DZ電活動的影響

對17只夾尾刺激大鼠進(jìn)行BLA、DZ放電頻率直方圖分析，結(jié)果顯示在夾尾刺激后共有8只大鼠BLA、DZ出現(xiàn)放電頻率增高反應(yīng)，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明（圖4），反應(yīng)時BLA、DZ放電頻率相對刺激前有明顯增加（BLA：P

2.3.2 夾尾刺激對各生理指標(biāo)的影響

分析此8只大鼠在夾尾刺激前、刺激時、刺激后呼吸肌肌電頻率，結(jié)果顯示刺激時較刺激前大鼠呼吸頻率增快（圖5A，P<0.05），刺激后又恢復(fù)到原來水平（P<0.051。8只大鼠的心電分析顯示，夾尾刺激誘發(fā)大鼠心跳加快（P0.05）。

2.4 電刺激誘發(fā)的反應(yīng)

2.4.1 電刺激對BLA、DZ電活動的影響

對17只大鼠電刺激前2 min和電刺激后2min數(shù)據(jù)進(jìn)行放電頻率直方圖分析，結(jié)果顯示有15只大鼠核團(tuán)放電頻率刺激后相對刺激前有所增加（圖6，BLA：P=0.072， DZ： P<0.05），其余2只大鼠未誘發(fā)此類反應(yīng)。選取15只大鼠在電刺激后2 min的BLA和DZ放電頻率作相關(guān)性分析，結(jié)果顯示r=0.348， P=0.204，說明相關(guān)性沒有統(tǒng)計學(xué)意義，較基礎(chǔ)值相關(guān)性有所降低。

2.4.2 電刺激對各生理指標(biāo)的影響

分析此15只大鼠在電刺激前、后呼吸肌肌電頻率，結(jié)果顯示呼吸頻率幾乎沒變化（圖7A，，P=0.712）。心電分析（圖7B）顯示，刺激后大鼠心跳加快（P<0.01），之后未恢復(fù)到刺激前狀態(tài)（反應(yīng)時、反應(yīng)后：P>0.05；反應(yīng)前、反應(yīng)后：P<0.05），體溫和皮膚電導(dǎo)分析后亦兀明顯變化（P>0.05）。

2.5 不同傷害性刺激影響腦內(nèi)BLA、DZ電活動的比較

2.5.1 影響B(tài)LA電活動的比較

計算8只大鼠BLA放電頻率在不同傷害性刺激下反應(yīng)時相對于刺激前的變化率，將各種刺激引起變化率的差異進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示3種傷害性刺激引起B(yǎng)LA放電頻率的改變有差異（表1，One -way ANOVA，F(xiàn)=4.814，P<0.05），兩兩比較結(jié)果顯示.8只大鼠熱刺激BLA放電變化率高于夾尾刺激的變化率（P=0.02）和電刺激的變化率（P=0.01），說明50 ℃熱刺激比夾尾刺激、電刺激更易誘發(fā)明顯的BLA放電頻率的變化，而夾尾刺激和電刺激之間BLA放電頻率變化沒有顯著性差異（P=0.763）。

2.5.2 影響DZ電活動的比較

計算8只大鼠DZ放電頻率在不同傷害性刺激下反應(yīng)時相對于刺激前的變化率，將各種刺激的變化率的差異進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示3種傷害性刺激引起DZ放電頻率亦有差異（表l，One-way ANOVA，F(xiàn)=5.740，P<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，8只大鼠熱刺激引起的DZ放電頻率變化率高于夾尾刺激誘發(fā)的變化率（P=0.028）和電刺激的變化率（P=0.004），由此說明熱刺激比夾尾刺激、電刺激更易誘發(fā)明顯的DZ放電頻率的變化。同樣，夾尾刺激和電刺激之間DZ放電頻率變化也沒有顯著性的差異（P=O.361）。

3 討論

本實驗在大鼠進(jìn)行腦內(nèi)雙核團(tuán)細(xì)胞外記錄和多導(dǎo)生理指標(biāo)同步記錄基礎(chǔ)上，選擇了熱刺激、夾尾刺激、電刺激作為誘發(fā)疼痛的手段.腦內(nèi)記錄區(qū)域選擇了與疼痛過程中密切相關(guān)的痛情緒代表核團(tuán)BLA和痛感覺代表區(qū)域DZ，在同步記錄大鼠在痛覺過程中腦內(nèi)BLA和DZ放電活動的變化的同時，觀察反映情緒的生理指標(biāo)。結(jié)果顯示不同傷害性刺激均可在三方面記錄指標(biāo)上產(chǎn)生顯著性影響。表明本實驗技術(shù)不僅能夠檢測在傷害性刺激的作用下中樞神經(jīng)系統(tǒng)的痛感覺代表區(qū)域和痛情緒的代表核團(tuán)的放電頻率，還能將反映情緒的外周生理指標(biāo)一并分析，形成了一個綜合的痛覺記錄系統(tǒng)，是一種可行的心理生理學(xué)研究的技術(shù)。

本實驗所用的傷害性刺激方案參照各類文獻(xiàn)的做法，每種傷害性刺激為引起大鼠發(fā)生痛反應(yīng)的閾值刺激，從而使得傷害性刺激之問具有可比性。對不同傷害性刺激下的中樞腦電發(fā)放情況進(jìn)行了一系列分析。結(jié)果表明，大鼠在接受熱刺激和夾尾刺激后痛感覺代表區(qū)域DZ和痛情緒代表核團(tuán)BLA腦電活動都較反應(yīng)前有大幅度的增加，一段時問后又恢復(fù)到之前的水平。而電刺激后，痛感覺的代表區(qū)域DZ腦電頻率反應(yīng)時較反應(yīng)前有明顯增加；而代表痛情緒的腦部核團(tuán)BLA腦電頻率增加無統(tǒng)計學(xué)差異。由此可以看出，電刺激誘發(fā)的BLA放電沒有熱刺激和夾尾刺激強(qiáng)，推測可能是處理情緒的中楸對熱刺激和機(jī)械性刺激（夾尾）更加的敏感，更易產(chǎn)生反應(yīng)。為深入探討不同種傷害性刺激之問所誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)電活動的差異，本實驗采用的單因素方差分析（One-way ANOVA）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱刺激、夾尾刺激、電刺激之問的痛感覺和痛情緒反應(yīng)是具有顯著性差異的，說明中樞神經(jīng)系統(tǒng)對疼痛處理過程是不相同的。由此，本文所采用的實驗方法可以很好地鑒別出不同種傷害性刺激，即說明不同種傷害性刺激所誘發(fā)的痛感覺和痛情緒的中樞代表區(qū)域的電活動是有差異的。各種刺激后腦內(nèi)BLA、DZ核團(tuán)電活動的相關(guān)性都有所改變，表明各種傷害性刺激后使得痛感覺、痛情緒反應(yīng)代表核團(tuán)之問的相互關(guān)系發(fā)生了一定的改變，尤其是央尾刺激后兩核團(tuán)之間的相關(guān)性，南此提示夾尾傷害性刺激后，可能導(dǎo)致痛感覺和痛情緒之問的聯(lián)系程度更加緊密，但是具體發(fā)生的機(jī)制需進(jìn)一步的研究。

本實驗在檢測到中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)時，同時檢測的外周生理指標(biāo)能夠反映大鼠情緒的變化，從而可以探討外周情緒指標(biāo)與反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的痛情緒指標(biāo)BLA腦電活動之間的關(guān)系。有趣的是在不同種傷害性刺激后，大鼠的心率都發(fā)生了很大程度的變化，呼吸肌肌電頻率在熱刺激和夾尾刺激都發(fā)生了相似性的反應(yīng)，電刺激并未誘發(fā)出呼吸肌肌電頻率的變化。單因素方差分析得到的結(jié)果有力證明了不同傷害性刺激所誘發(fā)的BLA放電活動是不相同的，但從3組實驗來看，除了電刺激時呼吸肌肌電變化不明顯，外周反映情緒的其他指標(biāo)都有相似的變化。同時，電刺激過程中BLA放電活動沒有發(fā)生顯著性變化，呼吸肌肌電頻率也沒有顯著性變化，推測代表中樞神經(jīng)系統(tǒng)痛情緒指標(biāo)（BLA電活動）與呼吸肌肌電有密切的聯(lián)系，而是否與心率的關(guān)系也密切，仍需進(jìn)一步的實驗研究。體溫、皮膚電導(dǎo)在本實驗過程中并未表現(xiàn)出很明顯的變化，究其原因可能在給予大鼠麻醉后，相關(guān)神經(jīng)中樞或調(diào)節(jié)機(jī)制受抑，故對外界的傷害性刺激未做出特征性反應(yīng)。