促紅細胞生成素受體基因與運動能力

黃政實

摘 ?要：人類體質及運動能力與其他性狀一樣，屬于多基因調控。從決定人體有氧運動能力的生理學基礎上看，血液中紅細胞、血紅蛋白的攜氧、運氧能力起著非常重要的作用。而人體中紅細胞的產生是受基因調控的，主要受促紅細胞生成素（EPO）基因和促紅細胞生成素受體（EPOR）基因作用。只有促紅細胞生成素（EPO）和促紅細胞生成素受體（EPOR）結合，引發一系列信號傳導，最終啟動相關基因轉錄，生成網織紅細胞和紅細胞。因此，研究促紅細胞生成素受體（EPOR）基因的多態性與紅細胞、血紅蛋白的關系，對于評定運動員的有氧能力及作為選取耐力項目運動員的指標是非常有意義的。

關鍵詞：紅細胞生成素受體;多態性;運動能力

中圖分類號：G804.22 ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ?文章編號：1002–3488（2014）05–0042–04

Acceptor Gene of Haemopoietin and Kinetism

HUANG Zheng-shi

（Hainan Senior Physical Education School， Haikou 570203， China）

Abstract： Physique and kinetism of human is similar with other traits， belongs to multi gene regulation. From the physiological basis which decided physiological aerobic kinetism of human， carrying and transporting oxygen ability of red blood cell and hemoglobin in the blood plays a very important role. However， red blood cell in the human body is regulated by gene， mainly by erythropoietin （EPO） gene and erythropoietin receptor （EPOR） gene. Only the erythropoietin （EPO） and erythropoietin receptor （EPOR） combing， priming a series of signal transduction， finally promoting related gene transcription， create reticulocytes and erythrocytes. Therefore， studying on the relationship of erythropoietin receptor （EPOR） gene polymorphism and ?red blood cell， hemoglobin， which is very meaningful for evaluation of aerobic capacity of athletes and as a selection index for athletes.

Key words： haemopoietin receptor; polymorphism; kinetism

1 ? ?引言

人類體質及運動能力的遺傳學研究已有相對較長的歷史，隨著科技的進步，先進研究方法的應用，使人們對人體運動能力與遺傳的關系有了更深一步的了解。多年來，人類體質及運動能力的個體差異究竟在多大程度上歸因于遺傳，一直是體育科學界較為關注的課題之一。從20世紀20年代國外開始進行研究體質及運動能力的生物學基礎及遺傳因素的調節作用，現今普遍認為與人類其他生物學性狀一樣，體質及運動能力也同樣屬多基因調控。隨著分子遺傳學對運動醫學的滲透，倘若能探明這些表型的基因標記或定位這些基因，不僅可以從根本上解決競技體育的早期選材的問題，而且可以在分子水平探討人類運動能力的生理機制。國內外學者經過大量的實驗調查研究發現，具有不同基因多態的人群，其在某一方面的運動能力有不同的表現。目前研究與耐力能力相關的基因較多，如血管緊張素（ACE）基因、磷酸肌酸激酶（CKMM）基因、促紅細胞生成素受體（EPOR）基因等。通過國外研究發現，ACE基因在第16號內含子存在一段286bp的重復序列為標記構成的I/D多態與耐力能力有明顯的相關。有報道[1]，澳大利亞64名劃艇運動員中ACE基因中I等位基因和II等位基因型的頻率顯著高于普通人群。而且有研究認為，在田徑項目中，運動距離越長，ACE基因插入多態的頻率越高。我國對ACE基因與耐力項目的關系[2-3]也有類似報道。

促紅細胞生成素（EPO）作為一種臨床常用促造血因子為人們熟知，而最新的一系列研究表明，EPO 尚存在多種非造血方面的作用，包括抗凋亡作用、促血管生成作用、神經保護作用等，這可能對多系統如腎臟系統、心血管系統、神經系統等具有潛在的應用價值，目前已經發現的多種 EPO 相關受體的結構與功能及其作用通路[4]。EPOR基因的多態性與運動能力的關系，目前國內外研究報道較少。從耐力項目運動能力的生理學基礎看，決定耐力項目運動能力的主要因素主要包括機體的心肺功能狀況、血液的攜氧、運動氧能力、肌肉組織氧的利用效率能力等。其中血液攜氧、運氧能力是耐力水平高低的一個關鍵因素之一。血液攜氧、運氧能力的高低取決于血液中紅細胞數目、血紅蛋白含量[5]。紅細胞數目多、血紅蛋白含量高，運動員的耐力水平高。因此，在運動實踐中用紅細胞數目、血紅蛋白濃度來評定機體的有氧能力水平已被認可。

人體中紅細胞的產生是受基因調控的，它主要是受促紅細胞生成素（EPO）基因和促紅細胞生成素受體（EPOR）基因作用。促紅細胞生成素（EPO）和促紅細胞生成素受體（EPOR）結合，引發一系列信號傳導，最終啟動相關基因轉錄，生成網織紅細胞、紅細胞。因此，研究促紅細胞生成素受體（EPOR）基因的多態性與紅細胞、血紅蛋白的關系，對于評定運動員的有氧能力及作為選取耐力項目運動員的指標是非常有意義的。

2 ? ?紅細胞生成素受體（erythropoietin receptor， EPOR）的生物學功能

2.1 ? ?EPOR及EPOR基因的結構

EPOR是紅系造血細胞表面上分布的受體，它與生長激、集落刺激因子（CSF）及一些白細胞介素的受體同屬一個受體家族，稱為造血細胞生成素家族。1989年D`Andrea等利用鼠紅白血病細胞成功地克隆了鼠EpoR[6]，1991年人的EPOR cDNA也被克隆成功，由此，使人們了解了鼠和人的EPOR的結構。人的EPOR共有507個氨基酸，分子量為55.24X103，其序列與小鼠有82 %的同源性。EPOR是I型膜糖蛋白，前24個氨基酸殘基形成一個信號肽，而其余的483個氨基酸殘基包括223個氨基酸殘基的激素結合域，24個殘基的跨膜域和236個氨基酸殘基的胞內域。胞外域有造血受體超家族共有的兩個特征：一套4個的半胱氨酸殘基和一個色氨酸-絲氨酸-X色氨酸-絲氨酸結構（Trp-Ser-X-Trp-Ser，即WSXWS，其中X代表任何一種氨基酸）的近膜結構，在WSXWS中有兩個W很重要，如將兩個W換成其他氨基酸，EPOR則失去EPO結合的能力，說明它起著穩定結構的作用。用X線晶體衍射方法測定出EPOR結構是一種螺旋束結構（helixbundle）。有兩個亞區（sub-domains），每個亞區含有7個折疊，結構中的4個半胱氨酸與鄰近的另一個受體形成二硫，以穩定EPOR結構。當EPO與EPOR結合時需要2分子的EPOR。同時具有這類特征的其他細胞因子受體包括：IL-2、3、4、5、6、7、9，GM-CSF，LIF，GH，催乳素，神經因子等。有報道[7]，通過EPOR的胞外域與IL-3Rβ113胞內域組成的嵌合體的研究發現，它們都能賦予表達細胞（Ba/F3）的分化特性。這表明受體的胞外域實際上是EPOR的關鍵分化功能域。從受體的羧基端依次切斷，再插入到Ba/F3細胞中，添加EPO來觀察細胞的增殖，當插入羧基端缺少40個氨基酸的縮短型時，對低濃度EPO（1 pmol/L）也有增殖反應。這是正常情況下刺激紅細胞系祖細胞增殖所需EPO濃度的1/10。這部分氨基酸的缺失，既不影響受體數目，也不影響受體親和力，但其存在使得刺激受體產生效應的EPO濃度較不存在時高10倍，說明羧基端的40個氨基酸序列具有將信息向下調控的作用，使EPO的生物效應明顯下降。當插入羧基端缺少133個氨基酸時，也有增殖反應。通過對EPOR胞內不同區域的刪除發現兩個功能相反的區域：近膜的大約100個含絲氨酸的區域傳導增殖信號，而遠離羧端區域下調這一信號，起到負調控的作用，具體位置[8]大約在羧基端40～90個殘基的區域內。

對于EPOR基因的結構研究人們也進行了大量的工作，通過把EPOR基因克隆與cDNA克隆相結合，第一次較全面的使人們認識了EPOR的整個基因結構，并為以后的表達調控研究奠定了基礎。基因組的克隆一般采用人胎盤EMBL3文庫，用hEPORcDNA作探針，而后將克隆再亞克隆至puc18載體，從而進行測序，其外顯子與內含子的邊界則由OCIM1mRNA的PCR克隆所得的cDNA序列相比較而確定[9]。EPORcDNA和基因結構表明，hEPOR的基因位于19 p13.3-13.2，接近著絲點（圖1），編碼區6.5 kb有8個外顯子和7個內含子，內含子序列從0.08 kb到2.1 kb，并包含與Alu高度同源的重復序列。外顯子包括5非翻譯端、信號肽區域及胞外的氨基端域。外顯子6編碼單一的跨膜區，胞內區由外顯子7、8編碼。

此基因3端不包括poly（A）加尾信號（AATAAA），另hEPOR序列中包括可能的調控序列轉錄因子（SP1）結合域（CCGCCC）、造血細胞系特異轉錄因子GATA-1結合域（TTATCT）。hEPOR基因序列從-0.8～-104 kb包括一個回文序列，但不包括CAP位點上游的TATA或CAAT序列，這兩個位點通常為轉錄因子和RNA聚合酶結合位點，來支持轉錄的基礎水平。Noguchi等及 Penny和 Forget[10-11]對EPOR基因結構的研究均類似報道。

2.2 ? ?EPOR的生物學功能

從晚期紅系祖細胞（CFU-E）發育成為成熟的紅細胞，EPO起著決定性的作用。體外人干細胞培養實驗中已證實，在早期紅系祖細胞（BFU-E）階級，開始有EPOR的合成，但是量少，反應弱，到晚期紅系祖細胞（CFU-E）階段是它的高峰期。在每個細胞表面大約有300～1 000個EPO結合點，其中20 %是高親合的（Kd=100 pmol/L），80 %呈低親合的（Kd=600 pmol/L）。相反在網織紅細胞表面沒有兩種類型受體結合點，只有一種類型（Kd=100～200 pmol/L）。高親合力的受體與EPO作用，低親合力的受體只與EPO結合，僅占位置不發生作用。由此，EPO是哺乳動物紅細胞生成的主要激素調控子，對于紅細胞前體細胞的生存、分化、成熟具有重要的作用。它的這種作用是通過和紅系造血細胞表面分布的EPOR結合發揮作用的。當EPO和EPOR結合后，EPOR在其胞外部分一個24個氨基酸殘基組成的片段的誘導下發生同種二聚反應，使與受體相連的Janus蛋白激酶（JAK2）發生轉磷酸化而被激活，使信號轉導劑和轉錄活化劑（signal transducers and activators of transcription， STAT）的酪氨酸殘基磷酸化，從而導致受體和細胞內的基質的酪氨酸磷酸化，活化的STAT與基因表達調節蛋白（48 KDa和43 KDa）結合共同調節基因表達，將信息傳遞到下流以至細胞核促進紅細胞系統的增殖和分化。JAK激酶家族是一組非受體型酪氨酸激酶，分子量約為130 KDa，包括JAK1、JAK2、JAK3、TYK2。其中，發現JAK2是信號傳導中具有重要作用的酪氨酸激酶，JAK2的活化是受體產生信號所必須的，它在受體受到刺激前就與受體結合，當EPO與EPOR結合時，JAK2自身發磷酸化而被活化，活化的JAK2首先將EPOR的酪氨酸殘基磷酸化，繼而具有SH2區域的若干信號傳導蛋白聚集到磷酸化的酪氨酸殘基上，直接地或間接地被JAK2酪氨酸磷酸化而被活化。STAT（Signal transducer and activator of transcription）家族是由STAT1-6組成，其基本構造為SH2、SH3區域和羧基末端具有酪氨酸殘基，通過SH2區域形成二聚體向核移行，產生與特定部位DNA結合的能力，識別特異的堿基序列，而制約著轉錄。STAT5為92 KDa的蛋白質，從STAT5優勢抑制型變異體抑制細胞增殖來看，STAT5在細胞增殖方面起著重要作用。

現還有報道，EPOR的信號傳導機制還有以下幾條：（1）EPOR-JAK2-PI3K（磷酸酰肌醇-3-激酶）;（2）EPOR-JAK2-ERKs（胞外信號調節激酶-1，2）;（3）EPOR-JAK2-KappaB（核因子KappaB）途徑;（4）EPOR-JAK2-Ras蛋白-MAPK（有絲分裂原活化蛋白激酶）途徑等。可見，EPO胞內信號傳導不是單一的級聯通路，而是多個通路[12]交聯、互補，形成網絡的復雜傳導過程。

3 ? ?促紅細胞生成素受體（EPOR）基因的多態性與運動能力的相關性

EPO作用于骨髓造血細胞，促進紅系祖細胞增生、分化，最終形成成熟的紅細胞，增加體內的血紅蛋白含量，提高血液對氧氣的攜帶、運輸能力，改善機體的有氧運動能力的生理學基礎。EPO的這一生理作用，只有通過與紅系造血細胞表面的EPOR結合，才能將細胞外的信號傳導到細胞內，引發造血細胞增生、分化形成紅細胞。EPOR對EPO的親和性的高低是EPO產生作用的主要因素之一，EPOR結構是由EPOR基因來調控的。因此，EPOR基因的結構對于轉錄、表達、產生對EPO有高度敏感的EPOR是起著決定作用。

關于EPOR基因的多態性與運動能力的研究國內外鮮有報道。1991年Juvonen等報道了一個家庭的EPOR基因在常染色體控制區的變化[13]，由于這個變化，此家族的EPOR對EPO的敏感性增加，造成血液中紅細胞增多。但這種紅細胞增多對機體的健康和壽命沒有病理上的影響，具有這種基因型的家族成員在奧運會和世界錦標賽上的耐力項目中取得了數枚金牌。1993年De la Chapelle等對同一家庭進行研究[14]，發現在EPOR基因5`端的這種簡單重復性多態與疾病有一定的關聯。EPOR基因的這一突變位置在6002核苷酸上由堿基G變為了堿基A，這一突變屬于無意義突變，它生成了一個終止密碼子TAG，結果蛋白產物的下游70個氨基酸被截去造成截斷產物的出現，使繼承性良性紅細胞增多癥產生。

關于EPOR基因上的一些突變引起EPOR蛋白的功能的報道國內外還有一些。1995年Sokol等研究[15]，在原發家族性或先天紅細胞增多癥（PFCP）的人群中，他們的EPOR基因的核酸序列5975處一個核苷酸G，可導致自編碼子430開始的移碼突變，使蛋白編碼提前終止，造成64個氨基酸缺失。為了進一步驗證，將這種移碼突變的EPOR5974 插入的堿基G轉染到Ba/F3細胞中，從而使其對EPO高度敏感。Kralovics等研究（1997）發現[16]，在捷克共和國的高加索人家庭中的EPOR基因在5967堿基后插入一核苷酸T，導致此類家族成員紅細胞增多。Arcasoy等（1997）研究顯示[17]，在有些家族中EPOR基因的第八外顯子上從堿基5 985-5 991有一段7bp的缺失，導致EPOR在C端有59個氨基酸截去。這一家族的個體中，有的人具有紅細胞增多，但此家族中沒有高血壓癥和心血管疾病發生。EPOR的基因突變也有可能造成它的敏感性減低，一些具有貧血癥或紅細胞生成障礙的病人，也有可能在EPOR基因存在著某些突變。

從EPOR基因的一些突變研究中，發現在EPOR基因中由于一些堿基的變異，影響到EPOR對EPO的敏感性的增加，使體內的紅細胞生成增多。由此，使體內攜氧、運氧能力的提高，改善機體的有氧運動能力。提示，是否可從EPOR基因的變異中找出某些具有較高頻率的突變即EPOR的一些多態位點，來為耐力項目運動員選材提供依據。

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