7株根瘤菌菌株與熱研2號柱花草共生最適磷濃度研究

董榮書 張潔 黃艷霞等

摘 要 采用水培的方法，設3個磷水平，7個菌株，通過對株高、莖葉鮮重、莖葉干重、固氮酶活性、莖葉氮含量、莖葉磷含量的測定及綜合分析，確定使熱研2號柱花草接種不同根瘤菌菌株達到最佳促生性能的磷濃度。結果表明：7個菌株在中磷時鮮重和含氮量最大，低磷不利于鮮重和含氮量的增加；經主因子綜合分析，菌株YM11-1、RJS9-2、PN13-3在高磷時對熱研2號柱花草有最好的固氮促生效果，菌株LZ3-2、BS1-1、PN13-3在中等磷條件下有最好的固氮促生效果，菌株FS3-1-1在高磷和中磷都有最好的固氮促生效果。

關鍵詞 熱研2號柱花草；根瘤菌；最佳促生效果

中圖分類號 S54 文獻標識碼 A

熱研2號柱花草[Stylosanthes guianensis（Aublet）Swartz cv. Reyan No.2]由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心選育自184柱花草（Stylosanthes guianensis CIAT184），在我國熱帶、亞熱帶地區有較強的適應性[1]。熱研2號柱花草具有莖葉產量高，適口性好，營養豐富，刈割后再生能力強，接種根瘤菌后固氮能力強的特性，在我國南方廣泛用于飼草、綠肥及水保[2-7]。接種高效根瘤菌是柱花草栽培的重要手段[8]，能有效的提高柱花草的產量及含氮量。目前在我國篩選出適合于熱研2號柱花草的高效菌株有6個[9]，相對于不接種可增產達4.98倍、含氮量增加可達2.04倍[10]。豆科植物接種根瘤不僅與植株與菌株基因型的搭配有關，還受外界環境的影響[11-12]。磷在豆科作物的生長和結瘤固氮過程中發揮著重要作用[13-14]。缺磷對豆科作物根瘤形成和生長的影響大于其對植物體生長的影響[15-16]，對大豆、蠶豆等作物的研究結果表明，在一定范圍內磷可以促進結瘤和固氮，但過多也會抑制根瘤的固氮效果[17-18]。在柱花草方面尚無對柱花草-根瘤菌體系最適磷濃度的研究，本研究通過水培對接種不同根瘤菌的熱研2號柱花草進行不同濃度的磷處理，確定使熱研2號柱花草接種不同根瘤菌菌株達到最佳促生性能的磷濃度，以期為柱花草高產栽培的科學用肥及根瘤菌的科學施用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

熱研2號柱花草由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所牧草中心提供；供試菌株[19]及來源見表1；磷源用KH2PO4（AR），不同磷處理間少的K用K2SO4（AR）補足。

1.2 方法

1.2.1 無菌種苗的準備 柱花草種子剝去種皮，在80 ℃的熱水中浸泡5 min；分別于95%的乙醇（V/V，下同）和2 g/L的HgCl2溶液中浸泡5 min和3 min（滅菌）；取出，用無菌水沖洗5～6次；種子撒播在已滅菌鋪有發芽紙的培養皿中，發芽紙上澆無菌的50 μmol/L硫酸鈣溶液；于黑暗中發芽。待芽長至1 cm左右時移到1.5 mL的切除底部的小離心管中培養，離心管事先分裝好MS培養基，離心管固定在0.2 cm厚的定植板上，最后將定植板放在裝有1/2 Hoaglang營養液[8]的面包箱中育苗2周。

1.2.2 根瘤菌菌液的準備 以YMA（Yeast Mannitol Agar）培養基作為基礎培養基，配制固體、液體培養基放置2 d確認無污染后將保存的各菌株活化于固體培養基上；培養5 d后將菌落接種于液體培養基中，在180 r/h、28 ℃搖床上培養至對數生長期（OD600>0.9）。

1.2.3 水培系統的準備、移苗及處理 水培試驗用2 L小桶，小桶先用1 g/L高錳酸鉀浸泡2 min然后用去離子水沖洗晾干，小桶外圍用黑色袋套住遮光。定植板用厚1 cm泡沫板，每塊泡沫板上四邊均勻鉆4個小洞。水培通氣裝置有通氣泵、通氣管、通氣石、通氣接口、定時器。

育苗2周后，將離心管帶苗移到小桶定植板上，用海綿固定。移苗后第一周用1/4 Hoaglang營養液穩定苗生長；移苗第二周用氮濃度100 mol/L的低氮營養液，同時接菌。將備用的菌液淋在根上，每株柱花草接5 mL菌液，并暫停通氣；3 d后再通氣。2周后每4 h通氣15 min。每周更換一次營養液；每2 d調一次營養液pH值至5.8。

1.2.4 試驗設計 采用雙因子隨機區組試驗。菌株因子設8個水平（即設8個處理，包括接種R1～R7根瘤菌和不接種對照R8）；磷濃度因子設PL（低磷）、PM（中磷）、PH（高磷）3個水平，磷濃度CP：分別為5、150、200 μmol/L；4次重復。營養液pH值為5.8。

1.2.5 取樣及各指標的測定 3個月后進行收獲。剪下莖葉稱鮮重后放入信封于烘箱105 ℃殺青20 min，75 ℃烘干后稱重。地上部干樣用于氮的測定。將樣品粉碎，先用H2SO4-H2O2進行消煮，用自動定氮儀（Kjedahl 2300）測定全氮。

用乙烯還原法通過氣相色譜測定根瘤固氮酶活性[8]。固氮酶活性以每小時每克鮮瘤將乙炔轉化為乙烯的能力表示[μmol/（h·g）]。

1.2.6 數據處理與分析 試驗中所有的數據均用Microsoft Excel 2000、JMP9等統計軟件進行統計和方差分析，以Tukey HSD作為差異顯著性標準，顯著水平p<0.01。

2 結果與分析

2.1 熱研2號柱花草接種不同根瘤菌鮮重和含氮量最佳磷濃度的確定

熱研2號柱花草接種不同根瘤菌莖葉鮮重在不同磷處理間差異顯著，不同菌株間變化情況也有差異。熱研2號柱花草接種7株菌株后莖葉鮮重在不同磷處理下的變化情況可分為3類：接種菌株R1、R2、R3后中磷的莖葉鮮重顯著高于高磷和低磷，高磷和低磷間差異不顯著；接種菌株R4后，中磷>高磷>低磷，三者差異顯著；接種菌株R5、R6、R7后，高磷和中磷間差異不顯著，低磷顯著低于二者。

熱研2號柱花草接種7個根瘤菌菌株在不同磷處理下莖葉含氮量除接種菌株R1差異不顯著外，其他6個菌株都呈現中磷顯著高于低磷且高磷與低磷差異不顯著的規律。

2.2 熱研2號柱花草接種根瘤菌的最適磷濃度的確定

通過對不同磷處理下熱研2號柱花草接種不同根瘤菌的株高、莖葉干重、固氮酶活性、莖葉氮含量、莖葉磷含量等指標進行因子分析，前2個因子的累積貢獻率達到79.58%（一般情況下，累積貢獻率超過75%即可），因此可提煉2個公因子。通過最大方差旋轉法得到旋轉因子載荷矩陣。在第一公因子（F1）中，株高、固氮酶活性、莖葉干重、莖葉含氮量等5個指標上具有大的載荷（一般情況下，將載荷絕對值大于0.4的視為高載荷），F1是除植株含磷量外的性狀的綜合體現，代表了熱研2號柱花草接種根瘤菌后在不同磷水平下的生物量和固氮能力，F1的方差貢獻率為58.63%；在F2中，植株含磷量具有較高的正載荷，F2可稱為植株含磷因子，該因子的方差貢獻率為20.95%。

根據各個觀測值在第一和第二主因子上的標準得分，繪制關于生物量和固氮能力（X軸）和植株含磷量（Y軸）的二維平面圖。R1H、R2M、R3H、R3M、R4H、R5M、R6M、R7H位于圖中的第1象限在生物量、固氮能力及植株含磷量上都是正值，熱研2號柱花草菌株接種菌株R1、R7的最適磷濃度為高磷，接種菌株R2、R4、R5、R6的最適磷濃度為中磷，接種菌株R3在中磷和高磷都能達到較好的固氮促生效果；R1L、R2L、R3L、R4L、R5L、R6L、R7L位于圖中的第3象限，在生物量、固氮能力及植株含磷量上都是負值，低磷條件不利于各菌株與熱研2號柱花草的共生固氮作用。

3 討論與結論

土壤缺磷是限制豆科作物生產的重要因素[20-21]，適量的磷不僅能促進植物的生長，還能促進豆科作物結瘤固氮作用，在豆科植物上有“以磷促氮”的說法[22]。程鳳嫻[23]在試驗中證明了磷對根瘤菌共生固氮起著重要的作用，磷能促進根瘤菌的固氮活性。在大豆的研究中當磷濃度為9.3～37.0 mg/L時，大豆的植株生長量、根瘤數、根瘤干重、固氮活性和氮積累量會大幅下降[17]。本研究不同磷處理對熱研2號柱花草接種不同根瘤菌后鮮重和含氮量的影響呈現低磷不利于熱研2號柱花草鮮重和含氮量的增加，中磷條件對柱花草鮮重和含氮量的促進作用最大，隨磷濃度的增加柱花草的鮮重和含氮量反而降低的規律，但不同菌株的接種效果存在較大的差異。接種菌株YM11-1、LZ3-2、FS3-1-1、RJS9-2在磷濃度為150 μmol/L時有最大的鮮重，接種菌株BS1-1、CJ1、PN13-3在150～200 μmol/L都有最大的鮮重，接種菌株LZ3-2、FS3-1-1、RJS9-2、BS1-1、CJ1、PN13-3在150 μmol/L的含氮量最大。齊敏興等[24]在不同磷水平對接種根瘤菌紫花苜蓿生長特性影響的研究中也得到類似的結果，但熱研2號柱花草最佳磷水平的磷濃度較紫花苜蓿的（1 000 μmol/L）低。

不同根瘤菌對磷素的需求量及吸收利用力存在很大的差異，豆科植物接種根瘤形成共生系統，磷對共生系統的影響主要由磷對根瘤和對植株的影響構成，研究結果表明：植物結瘤和保持固氮酶活性比正常生長需更多的磷[25-26]，但過高的磷會加大植株的呼吸強度，引起養分消耗，不利于植株的正常發育[27]。所以，根瘤菌高效固氮的條件篩選必須根據栽培目的選擇篩選的指標，通過綜合分析確定使植株和根瘤都達到最佳生長狀態的磷濃度。本研究在通過鮮重和含氮量確定熱研2號柱花草接種不同根瘤菌的最佳磷濃度的基礎上，加入莖葉干重、固氮酶活性、莖葉氮含量、莖葉磷含量等指標進行主因子分析，得出不同菌株與熱研2號柱花草共生的最適磷濃度，菌株YM11-1、RJS9-2、PN13-3在磷濃度為200 μmol/L時對熱研2號柱花草有最好的固氮促生效果；菌株LZ3-2、BS1-1、CJ1在磷濃度為150 μmol/L條件下有最好的固氮促生效果；菌株FS3-1-1在磷濃度為150～200 μmol/L都有最好的固氮促生效果。

參考文獻

[1] 蔣侯明， 何朝族， 李居正， 等. 熱帶優良豆科牧草——熱研2號柱花草的選育及推廣[J]. 熱帶作物研究， 1992（1）： 62-66.

[2] 蔣侯明， 何華玄. 熱研2號柱花草栽培及利用[J]. 草業科學， 1993（1）： 51-52.

[3] 鄭邦興， 沈裕芳. 柱花草在我省大農業中的應用[J]. 廣東畜牧獸醫科技， 1995， 20（3）： 31-32.

[4] 唐燕瓊， 吳紫云， 劉國道， 等. 柱花草種質資源研究進展[J]. 植物學報， 2009， 44（6）： 752-762.

[5] 莊道源， 黎學培， 黎金瓦. 膠園套種山毛豆和柱花草技術推廣[J]. 熱帶農業科學， 2011， 31（10）： 1-3.

[6] 白昌軍， 劉國道， 何華玄， 等. 海南半干旱地區芒果間作柱花草及作物效益初探[J]. 草地學報， 2003， 11（4）： 350-357.

[7] 蔡小艷， 賴志強， 易顯鳳， 等. 我國南方柱花草的利用現狀及發展對策[J]. 上海畜牧獸醫通訊， 2010（3）： 51-53.

[8] 林志強. 柱花草栽培技術[J]. 廣東農業科學， 2008（7）： 135-137.

[9] 董榮書. 熱研2號柱花草高效固氮根瘤菌的篩選[J]. 熱帶作物學報， 2013， 34（7）： 1-7.

[10] 董榮書. 柱花草高效固氮根瘤菌株系的篩選[D]. ?？冢?海南大學， 2010： 25-28.

[11] Pirbalouti A G， Allahdadi I， Akbari G A， et al. Effects of different strains of Rhizobium legominosarum biovar phaseoli on yield and N2 fixation rate of common bean（Phaseolus vulgaris L.）Iranian cultivars[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences， 2006， 9（9）： 1 738-1 743.

[12] Aguilar O M， Riva O， Peltzer E. Analysis of Rhizobium etli and of its symbiosis with wild Phaseolus vulgaris supports coevolution in centers of host diversification[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（37）： 13 548-13 553.

[13] Marschner H. Mineral Nutrition of Higher Plants. 2nd Edition[M]. London， Harcourt Brace & Company， 1995： 899.

[14] Robson A D， Ohara G W， Abbott L K. Involvement of phosphorus in nitrogen fixation by subterranean clover（Trifolium subterraneum L.）[J]. Australian Journal of Plant Physiology， 1981， 8（5）： 427-436.

[15] Ohwaki Y， Sugahara K. Active extrusion of protons and exudation of carboxylic acids in response to iron deficiency by roots of chickpea（Cicer arietinum L.）[J]. Plant and Soil， 1997， 189（1）： 49-55.

[16] Israel D W. Investigation of the role of phosphorus in symbiotic dinitrogen fixation[J]. Plant Physiology， 1987， 84（3）： 835-840.

[17] 丁 洪， 李生秀. 磷素營養與大豆生長和共生固氮的關系[J]. 西北農業大學學報， 1998（5）： 70-73.

[18] 王清湖， 敬 巖， 張 慧， 等. 接種根瘤菌和施磷肥對蠶豆共生固氮及產量的影響[J]. 甘肅科學學報， 1996（4）： 16-19.

[19] 董榮書， 黃艷霞， 劉國道， 等. 柱花草根際土著根瘤菌的豐度及其遺傳多樣性[J]. 熱帶作物學報， 2010， 31（6）： 908-913.

[20] Yan X L， Beebe S E， Lynch J P. Phosphorus efficiency in common bean genotypes in contrasting soil types. Ⅱ. Yields response[J]. Crop Science， 1995， 35： 1 094-1 099.

[21] 廖 紅， 嚴小龍. 華南酸性紅壤中菜豆種質耐低磷特性的評價[J]. 華南農業大學學報， 1998， 19（2）： 20-25.

[22] 晁明亮. 以磷增氮[J]. 安徽農業科學， 1963（1）： 62-63.

[23] 程鳳嫻， 曹桂芹， 王秀榮， 等. 華南酸性低磷土壤中大豆根瘤菌高效株系的發現及應用[J]. 科學通報， 2008（23）： 2 903-2 910.

[24] 齊敏興， 劉曉靜， 張曉磊， 等. 不同磷水平對接種根瘤菌紫花苜蓿生長特性的影響[J]. 草原與草坪， 2013（1）： 50-53.

[25] 劉麗君， 孫聰姝. 氮肥對大豆結瘤及葉片氮素積累的影響[J]. 東北農業大學學報， 2005， 36（2）： 133-137.

[26] Li X L， Cao Y P. Study on m ethod for investigating nutrient changes in the hypae-so il inte rface[J]. Beijing Ag ric Univ， 1992， 18（1）： 59-63.

[27] 東北師范大學生物系. 大豆生理[M]. 北京： 科學出版社， 1981： 204-206.

責任編輯：沈德發