芍藥甙對高膽固醇血癥家兔離體Oddi括約肌肌環張力作用的影響

王芳等

【摘 要】目的：觀察芍藥甙對高膽固醇血癥（hypercholesterolemia， HC）家兔離體Oddi 括約肌肌環收縮活動的影響。方法：純種新西蘭大耳白家兔16只隨機分成兩組：對照組（control， CON）和高膽固醇血癥（hypercholesterolemia， HC）模型組各8只，CON組飼以標準飼料，HC組飼以標準飼料+膽固醇（cholesterol， Ch），共飼8周。分別取兩組SO制備成離體肌環，放置于平滑肌恒溫灌流浴槽中，觀察累積濃度芍藥甙對SO肌環的舒張反應。結果：當芍藥甙濃度累積達（100nmol/L、1?mol/L、10?mol/L、100?mol/L）時，對兩組的SO肌環都產生劑量依賴性舒張作用（P﹤0.01）。但是模型組明顯弱于對照組。結論：在離體條件下，芍藥甙對正常兔和高膽固醇血癥兔Oddi括約肌肌環均能產生劑量依賴性舒張作用，但高膽固醇血癥兔Oddi括約肌肌環舒張性較正常兔下降，具體作用機制有待進一步研究。

【關鍵詞】芍藥甙；Oddi括約肌肌環；Oddi括約肌功能障礙；高膽固醇血癥

【文章編號】1004-7484（2014）02-0456-02

近些年來，對SO生理性的認識已日益深入，加快了對SO病理生理條件下動力學變化的研究。早在1887年意大利生理學家Oddi發現SO時就指出，部分患者不明原因的腹痛、發熱或黃疸可能是SO功能或器質性病變引起。經過國內外近20年的研究，Oddi括約肌運動功能障礙（sphincter of Oddi dysfunction， SOD）不但是大多數膽系疾病發病機制的主導環節，而且是這些疾患關鍵的繼發病理生理改變。在膽道外科手術中，特別是肝膽結石的再手術率很高，復發結石是常見原因之一。通過對SO動力學改變與術后結石復發關系的研究，對膽道結石或膽管結石，由于各種原因如炎癥、手術、高脂餐致使SO的“泵”功能障礙，加之膽囊排空功能損傷，膽汁排出受阻淤滯，膽汁成分改變，在成核因素作用下最終形成結石。杜凡等[1]發現高膽固醇使兔的SO基礎壓升高、收縮幅度降低，造影示SO有明顯狹窄，而高膽固醇的持續存在進一步加大膽囊排空阻力使膽囊運動功能受損。魏經國等[2]對高膽固醇血癥誘發Oddi括約肌功能紊亂實驗研究中發現，高膽固醇可損害膽管Oddi括約肌的舒張功能，誘發Oddi括約肌功能紊亂，導致膽管Oddi括約肌排膽阻力增加而致膽囊淤膽。

臨床上對Oddi括約肌功能紊有效的的治療目前是經內鏡括約肌切開，但是由于是一種有創的治療，易引起胰腺炎的并發癥，應用藥物治療在臨床上取得了一定的療效。芍藥甘草湯是張仲景《傷寒論》的經典名方，具有酸甘化陰，緩急止痛的功效，能夠緩解平滑肌痙攣。芍藥甙是中藥芍藥甘草湯中芍藥的有效成分，我們以前的研究證明，芍藥甙能夠對正常預處理收縮的兔SO肌環具有舒張作用。本實驗我們通過制作高膽固醇血癥（HC）兔模型，制備兔SO肌環，利用灌流法在離體條件下觀察芍藥甙對HC兔SO肌環收縮活動的作用，探討其對膽道平滑肌的作用及可能的機制。

1 材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗儀器

PZ-1生物張力傳感器（北京微信斯達科技發展有限公司）

BL-410生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）

TM_WAVE生物信號采集與分析軟件（成都泰盟科技有限公司）

HW-400E恒溫平滑肌槽（成都泰盟科技有限公司）

SMZ 800解剖顯微鏡（Nikon，Japan）

電子天平（型號：FA2004，d：0.1mg）

1ml可調式移液器。

1.1.2實驗試劑和藥物

芍藥甙（批號TCM068-081221，南京替斯艾么中藥研究所）

EGTA，美國Sigma公司；

氯化乙酰膽堿（Acetylcholine Chloride， Ach），美國Sigma公司；

膽固醇（分析純），上?；瘜W試劑公司；

二甲基亞砜（DMSO），天津化學試劑公司；

HEPES緩沖鹽，美國Amresco公司；

NaCl，KCl，NaHCO3，MgCl2，NaH2PO4，葡萄糖（分析純），天津化學試劑公司。

以下各種液體中成分均以毫摩爾/升（mmol/L）為計量單位。

Krebs-Henseleit（K-H）液（mmoL/L）：NaCl 118.3， KCl 4.7， NaHCO3 25.0， MgSO4 1.2， KH2PO4 1.2， CaCl2 2.5， glucose 11.0， pH=7.4；

1.1.3實驗動物

純種新西蘭大耳白家兔，體重2.5～3.0kg，雌雄不限，由大連醫科大學實驗動物中心提供。

1.2實驗方法

1.2.1高膽固醇血癥家兔模型的制作

純種新西蘭大耳白家兔16只，2～3個月齡，體重2.5～3.0kg，隨機分為2組，每組8只。對照組（CON）：飼以標準飼料；實驗組（HC）：飼以標準飼料+Ch，每日1g，每周6d，停喂1d，共飼8周。高Ch血癥模型判定標準[人類疾病的動物模型1982：120-129]：兔血清總Ch濃度小于3.0mmol/L為正常，大于10mmol/L為達到高Ch血癥標準。分別于喂Ch前、過程中、測試前取靜脈血測量血清總Ch含量。實驗開始前將血清總Ch大于3.0mmol/L兔剔除。

1.2.2 SO肌環的制備

取家兔，經耳緣靜脈注入約10mL空氣處死兔迅速分離SO段，在解剖顯微鏡下小心去除SO周圍脂肪與結締組織，取其近心段并修剪成橫徑為4mm的肌環，對角線固定于通氣管和張力換能器之間，置入含10ml K-H液的浴槽中，保持37℃恒溫并持續通入體積分數為5%CO2 和95% O2的混合氣體。

1.2.3 SO最適靜息張力的調節[3]

將肌環置于K-H液中溫育，首先給予1.0g初始前負荷，在平衡的過程中，不斷調節張力，使其穩定在初始前負荷水平，每隔20min更換一次浴槽內的K-H液。平衡60min后以60mmol/L的KCl為激動劑，以0.2g為步幅逐步提高前負荷反復觀察，直至其產生最大收縮力。此時的靜息張力即為最適靜息張力，隨后實驗均在各肌環最適靜息張力下進行。

1.2.4 芍藥甙對SO肌環張力的作用

實驗組（n=8）采用累積加藥法，每3min加芍藥甙1次，使灌流液中芍藥甙終濃度分別達10nmol/L，100nmol/L，1?mol/L，10?mol/L，100?mol/L，觀察芍藥甙對SO肌環的作用；對照組（n=8）以同樣方法累積加藥，每3min加芍藥甙1次，使灌流液中芍藥甙終濃度分別達10nmol/L，100nmol/L，1?mol/L，10?mol/L，100?mol/L，觀察芍藥甙對SO肌環的作用。

1.2.5 統計學方法

比較各組給藥前后SO肌環收縮的程度，計算藥后的收縮幅度與藥前的比值。采用SPSS16.0軟件包對數據進行統計學處理，數據用均數±標準差（ ）表示，兩組間比較采用t檢驗， P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1血清總膽固醇濃度

正常兔血清總膽固醇Ch濃度﹤3.0mmol/L，與人血清總Ch濃度正常值近似（2.9～6.0 Ch）。參照復制兔動脈粥樣硬化模型的方法[4]，本實驗將血清總Ch濃度﹥10.0 mmol/L定為高Ch血癥。各組兔喂Ch前血清總Ch濃度均正常[（1.4±0.8）vs （1.5±0.3） mmol/L， P﹥0.05]，8周后，實驗組兔血清總Ch濃度明顯升高（27.9±1.8）mmol/L，而對照組無明顯變化（1.6±0.5）mmol/L，兩組統計P﹤0.05，差異顯著，實驗組符合高Ch血癥動物模型標準。

2.2兩組肌環的物理參數

如表所示，兩組SO肌環的外徑、長度、重量均無顯著差異。

2.3 芍藥甙對SO肌環的舒張作用

先用60mmol/L的KCl預收縮肌環，等收縮力平穩后，加入累積濃度（10nmol/L～100?mol/L）的芍藥甙，記錄不同濃度下肌環舒張的百分率，由圖看出與對照組相比，HC組SO肌環對芍藥甙的舒張反應在各個濃度點明顯降低。在100nmol/L時，HC組舒張率為19.6%，較對照組降低39%（P<0.01）；1?mol/L時，HC組舒張率為35.7%，較對照組降低41%（P<0.01）；10?mol/L時，HC組舒張率64.3%，較對照組降低24%（P<0.01）；100?mol/L時，HC組舒張率為73.8%，較對照組降低21%（P<0.01）。上述結果表明HC組對芍藥甙舒張反應在上述各個濃度點均明顯較對照組下降（P<0.01）。

3 討論

SO位于膽總管、胰管與十二指腸交界處[5]，十二指腸乳頭周圍，由膽總管末端擴約肌、胰管擴約肌及壺腹括約肌三部分組成，為復雜肌性結構，富含平滑肌纖維。可分為固有肌和十二指腸延續肌纖維2類。固有肌有內外2層：內層主要為縱行肌，外層主要為環行肌，分別圍繞管周圍[6]。依靠其節律性收縮與舒張調節膽汁與胰液的排除，同時阻止十二指腸內容物返流入膽道和胰管，括約肌功能異?？梢愿淖冞@種節律性的調節作用，誘發或加重膽胰疾病。SO運動障礙可導致反復發作性膽道樣疼痛。膽囊切除術后綜合征、慢性反復發作性胰腺炎均與SO運動障礙有關[7-8]。有人認為SO活動異常與膽道結石有密切關系[9]，因為基礎壓的升高，逆蠕動增加使膽汁潴留易于形成膽結石。SO功能異常包括器質性和功能性兩大類，前者為括約肌炎癥狹窄和纖維化，后者為SO的動力障礙，其癥狀與胃腸道功能紊亂類似，此時括約肌雖有收縮，但其生理功能已大打折扣。

SOD根據發病機制分SO狹窄和SO動力障礙兩大類。狹窄由炎癥、創傷、感染、結石、瘢痕等因素引起，SO動力障礙為SO的功能性失調，引起膽管或胰管的間歇性梗阻、括約肌痙攣，影響平滑肌功能可能是動力障礙的一個機制。

高膽固醇飲食已經被認為是健康的十大危險因素之一，它可能誘導循環系統疾病，膽道系統疾病，腎臟疾病，以及多種癌癥。高膽固醇飲食和膽汁淤積之間的關系已經成為醫學科學研究的重要課題。SO是膽汁流出的唯一通道，因此SO的功能障礙與膽囊膽汁淤積密切相關。SOD的主要癥狀就是SO的壓力增高以及膽囊體積的增加。臨床資料以及之前的發現都表明膽汁代謝紊亂可以導致SO的功能障礙，這是由SO持續性的收縮所導致的一系列的臨床癥狀，包括腹痛及黃疸。

中藥防治膽結石機理的實驗研究始于20世紀50年代末，隨著中西醫結合治療膽石癥的不斷發展和現代醫學對膽結石成因研究的不斷深入，中藥防治膽結石機理的實驗研究水平、技術也在不斷提高。研究涉及了中藥對膽道系統功能、膽固醇、膽紅素代謝及膽道感染的影響，以及對膽結石形成具有重要意義的其他領域，初步揭示了中藥防治膽結石的機理。早期的實驗研究多圍繞藥物的泌膽和排膽效應，從膽汁流量、膽囊、膽道括約肌以及十二指腸的運動機能等四個環節進行動物實驗，隨著人們對膽汁成分改變在膽結石形成方面具有重要作用的認識，中藥對高脂血癥的影響一度成為研究熱點，研究水平有了進一步的提高。中醫認為膽石癥的成因主要與肝膽有關，肝膽互為表里，同主疏泄，在生理上相互協調，在病理上互相影響.膽汁的生成和排泄由肝臟的疏泄功能控制和調節。肝氣調達，疏泄正常，則膽汁排泄暢達；若情志不舒或暴怒傷肝，致使肝氣郁結，肝失疏泄，導致膽汁排泄不暢，膽汁阻遏郁滯，郁而化熱生火，火灼膽液，為砂石；肝經濕熱，肝挾濕內擾于膽府，肝膽濕熱互結，使中精之府濕熱終日彌漫，膽汁渾濁，濕熱薰蒸煎熬膽液日久成石。

中醫認為[10]，SOD病屬“脅痛”、“黃疸”范疇，辨證證型有肝郁氣滯、胃失和降、濕毒內蘊、發為黃疸型等，其病機為濕熱蘊結、肝膽疏泄功能失常、脾胃運化不足、血瘀血熱、腑實不通等。國內學者有關中醫中藥對平滑肌的舒張進行了大量的研究。尹本如等[11]證實重用大黃可疏通毛細膽管內的膽汁瘀積并且增加膽管舒縮功能，降低粘稠度，增加膽流，使膽囊收縮，舒張SO。李紅芳等[12]報道大黃水煎劑可濃度依賴性地降低Oddi括約肌收縮波平均振幅和張力，減慢其節律性收縮頻率，表現出抑制效應?，F代藥理研究發現[13]：中藥厚樸中含有一種酚羥基的生物活性物質厚樸酚，能抑制細胞外鈣內流，顯示鈣通道拮抗劑的特性。大黃素對大鼠和家兔離體回腸具有雙向調節作用[14]，可通過增加細胞內 Ca2+的濃度，促進信號轉導，加強胃腸運動[15]，這種作用對腸麻痹及痙攣可有調節治療作用；中藥成方或單味藥的有效成分對改善SOD的作用機制有待進一步觀察和深入。此外， 有實驗發現[16]，甲基蓮心堿（Nef）對SO和膽道均有與戊脈安相似的阻止外鈣內流導致SO松弛的作用，并且發現Nef對膽道平滑肌的作用不同于血管平滑肌，他不拮抗去氧腎上腺素的收縮作用，為探索藥物治療SOD提供了實驗理論依據[17-18]?？傊駷橹惯€沒有發現一種特異性作用于SO的藥物。Wei JG et al.[19-21]已經觀察到HC兔SO細胞[Ca2+]i處于過載狀態。基于以上認識，本實驗應用芍藥甙對高膽固醇血癥家兔離體Oddi括約肌肌環張力作用的影響。

本實驗中，我們建立了高膽固醇血癥模型并進行了芍藥甙對Oddi括約肌肌環的影響，結果發現，給予家兔以高膽固醇飼料喂養后，其血清膽固醇含量明顯升高，表明進食高膽固醇飼料可形成家兔的高膽固醇血癥模型，與文獻報道的較為一致[22]，家兔本身對膽固醇膳食的敏感性較高，對外源性膽固醇吸收率達75%～95%，對高膽固醇血癥清除能力低，易于建立模型。對各實驗組記錄芍藥甙對離體Oddi括約肌肌環收縮活動的直接作用與對照組比較，給予高膽固醇血癥飼料喂養的模型組，存在SO肌環的舒張作用，但其作用明顯弱于對照組（P﹤0.01）。

研究表明，芍藥甙對正常純種新西蘭大耳白家兔離體Oddi括約肌肌環具有劑量依賴性舒張作用，對高膽固醇血癥兔的這種作用依然存在，但是被弱化，說明經過高膽固醇飼料喂養后，SO運動功能增強，提高了SO張力，導致SOD [24]，從另一方面說明，SOD后Oddi括約肌舒張功能減弱。

我們以前的研究結果表明，芍藥甙對SO肌環的舒張作用是通過多種途徑實現的。芍藥甙可能通過對Kv通道和BKCa通道的調控，實現了對正常家兔Oddi括約肌肌環的舒張反應；另一條途徑可能與阻斷平滑肌細胞內質網上的三磷酸肌醇敏感的鈣離子通道，抑制內鈣的釋放有關。在離體條件下，我們又初步觀察到芍藥甙對高膽固醇血癥兔SO肌環也具有舒張作用，其作用機制是否與芍藥甙對正常家兔SO肌環的舒張作用一致？有待進一步研究闡明。

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