熒光紅–曙紅Y能量轉移熒光猝滅法測定痕量鋅

賀元文 呂昌銀 宋鴻志

【摘 要】目的：建立一種新的能量轉移熒光法測定頭發中痕量鋅。方法：在λex/λem=450nm/553nm，乳化劑OP存在下，熒光紅（FR）-曙紅Y（EY）能夠發生有效能量轉移，使EY熒光強度大大提高；而Zn2+與1-（2-吡啶偶氮）-2萘酚（PAN）形成配合物的吸收光譜與FR-EY能量轉移體系的發射光譜有效重疊，再次發生能量轉移，使FR-EY體系熒光猝滅，從而建立痕量鋅的測定新方法。結果：在實驗最適條件下，Zn2+濃度5.2～450ng/ml范圍內與熒光猝滅程度呈良好的線性關系（r=0.9993）。方法的檢出限為2.01ng/ml；相對標準偏差為0.85%～1.72%（n=11）；樣品加標回收率為98.0%～101.5%。結論：方法簡便、靈敏度高，用于頭發中痕量鋅的測定，結果滿意。

【關鍵詞】鋅；熒光紅；曙紅Y；能量轉移；熒光猝滅法

【中圖分類號】R19 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）02-0756-02

鋅，對人體而言是一種極為重要的微量元素，有“生命的元素”之稱。缺鋅會影響DNA，RNA及蛋白質的合成，造成生長遲緩，智力衰退等。兒童缺鋅會引起厭食癥、侏儒癥等。因此，研究痕量鋅的測定方法在生命科學和生物醫學上具有重要意義。

能量轉移熒光分析法具有所需儀器簡單、靈敏度高、樣品量少、分析速度快等優點，已經成為一種有效的痕量分析技術[1]。此分析方法應經應用于生物大分子、痕量有機物[2-3]、及無機離子鐵[4]、銅[5]、磷[6]、錳[7]等的定量測定。根據F?rster能量轉移理論，研究了在乳化劑OP存在下，熒光紅（FR）和曙紅Y（EY）之間發生的能量轉移。FR的發射光譜和EY的吸收光譜基本重疊，FR作為能量給予體將自身能量轉移給能量接受體EY，使曙紅Y熒光強度大大增強。而PAN- Zn2+配合物吸收光光譜與FR-EY能量轉移體系的發射光譜有效重疊，再次發生能量轉移，使EY的熒光猝滅，由此建立了雙重能量轉移熒光猝滅測定痕量鋅的新方法。方法簡便、靈敏度高，用于頭發中痕量鋅的測定，結果滿意。

1 材料與方法

1.1 儀器與主要試劑

F-4500熒光分光光度計（Hitachi）；UV-8500紫外可見分光光度計（上海天美）；PB-20（PB-S）型精密酸度計（Sartorius Co. Ltd）。

鋅標準溶液（1.0μg/ml）：準確稱取0.4424g ZnSO4·7H2O用水溶解定容到100ml，配制成1.00mg/ml的貯備液，使用時稀釋成標準工作液；熒光紅溶液：5.0×10-5mol/L乙醇溶液；曙紅Y溶液：4.0×10-4mol/L；PAN：300mg/L（用無水乙醇配制）；乳化劑OP溶液：5%（V/V）；NaF溶液：4.0mg/ml。

所用試劑均為分析純，用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

于10ml比色管，依次加入FR溶液0.5ml，EY溶液1.0ml，乳化劑OP溶液1.5ml，PAN溶液1.0ml，適量的鋅標準工作液，最后用水稀釋至刻度，搖勻。室溫下（20℃左右）放置10min，在熒光分光光度計上于λex =450nm，λem=553nm處測定溶液的熒光強度F和試劑空白熒光強度F0，計算△F=F0-F。以△F對Zn2+濃度繪制標準曲線。

2 結果與討論

2.1 熒光紅-曙紅Y的能量轉移

根據F?rster能量轉移理論，分子間發生能量轉移的必要條件是給體的發射光譜與受體的吸收光譜要有足夠的重疊。FR的熒光峰524nm和EY的吸收峰波長520nm能很好重疊[8]，為二者之間發生能量轉移提供了前提條件。由于體系的濃度均在10-4mol/L以下，若在稀溶液中仍能發生能量轉移現象，必須縮短分子間距離。加入表面活性劑能夠降低表面張力形成膠束，起到縮短分子間距離的作用。實驗選擇加入表面活性劑OP，用EY吸收微弱的端部波長450nm去激發FR-EY混合體系，既可以保證FR有較大吸收而EY不會被激發，使能量轉移轉移效果較好。由圖1可見，在乳化劑OP存在下，FR和EY的熒光峰波長分別為524nm和553nm。當FR和EY同時存在時，EY的最大發射波長不變，但其熒光強度明顯增大，即FR作為能量給體將自身能量轉移給接受體EY，使EY熒光強度大幅度提高。

2.2 光譜特性

按照實驗方法測得FR-EY、FR-EY-PAN、FR-EY-Zn2+混合體系的熒光光譜。結果表明：在乳化劑OP溶液中，FR-EY能量轉移體系的熒光峰為553nm，加入PAN后峰形峰位都沒有改變，只是熒光強度略有降低，實驗中不加入PAN，只加入Zn2+，圖譜基本不變，認為FR、EY與Zn2+不發生反應。在λex=450nm處測得FR-EY-PAN-Zn2+體系熒光光譜如圖2所示。圖3為PAN-Zn2+ 配合物的紫外可見吸收光譜。由圖3可見，單獨PAN的吸收峰位于477nm，加入Zn2+后，吸收曲線發生明顯變化：在PAN最大吸收波長處，吸光度逐漸降低；540～580nm處的吸收增強，在555nm處產生新的吸收峰，而且其吸光度隨Zn2+含量增加呈線性增大，表明二者反應形成了配合物。

在乳化劑OP溶液中，PAN-Zn2+ 配合物的吸收峰555nm與FR-EY能量轉移體系的熒光峰553nm較大重疊。即PAN-Zn2+ 加入可有效吸收FR-EY能量轉移體系的熒光，并使其猝滅。由此可建立FR-EY能量轉移熒光猝滅法測定Zn2+的新方法。

2.3 試劑用量的影響

研究了FR、EY、PAN用量對體系熒光猝滅值△F的影響，結果表明當FR和EY的體積比為1﹕2時，體系的△F值達到最大且穩定，本文選用5.0×10-5mol/LFR溶液0.5ml；4.0×10-4mol/LEY溶液1.0ml。

PAN用量太少，配合反應不完全；PAN用量過多，PAN本身吸收激發光使空白熒光值降低，△F值也降低，300mg/L的PAN用量在0.80～1.2ml時，△F值最大，實驗中加入1.0ml。

2.4 介質和酸度的影響

本文試驗了醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸緩沖液、Tris-HCl等不同緩沖體系以及pH3.0～11.0范圍內的酸度對體系的影響。結果表明：酸度對體系影響不大，而且與不加入緩沖溶液的體系（接近中性）的△F值相近。實驗中不加緩沖溶液，操作更為簡便。

2.5 表面活性性劑的選擇及用量的影響

本文對表面活性劑CTMAB、CPB、SDBS、SLS、乳化劑OP、Tween20、PVA對體系的敏化作用進行比較研究。結果發現：當加入乳化劑OP時，體系熒光曲線發生明顯變化，FR的熒光峰明顯下降，而EY熒光峰明顯上升，FR和EY之間發生了有效的能量轉移，熒光猝滅反應靈敏度最大。OP用量為1.2～1.8ml時，體系△F值基本不變，繼續增大用量靈敏度逐漸降低。實驗選擇加入1.5ml 5% OP溶液。

2.6 體系的穩定性

本文試驗了5～45℃溫度對測定體系△F值的影響，試驗表明：在15～30℃時，△F值達到最大且波動很小。實驗選擇在室溫（20℃左右）下操作，測定體系10min反應完全，90min內穩定。

2.7 線性范圍、檢出限與精密度

在選定最佳條件下，按照實驗方繪制工作曲線。結果表明：Zn2+濃度在5.2～450ng/ml范圍內服從比爾定律。線性回歸方程為△F=198.8+4012ρ（μg/ml Zn2+），線性相關系數r=0.9993。取21份試劑空白溶液進行測定，按3S/K計，本法的檢出限為2.01ng/ml。對Zn2+含量為0.1、0.25和0.40μg/ml的標準溶液進行11次平行測定，相對標準偏差為0.85%～1.72%。

2.8 共存離子的影響

對0.25μg/ml Zn2+的測定相對誤差≤±5%時，共存離子的允許量（以質量濃度倍數計）為：K+、Na+、Cl-、Br-（4000）； 、 、Ac-、I- （2000）；F-、 （1000）；Ba2+、Mg2+、Ca2+、Ce4+（100）；Ag+（40）；Pb2+（10）；Co2+ 、Mn2+（5）Fe3+、 Cu2+、Al3+（2）。在常見共存離子中Fe3+、 Cu2+、Al3+干擾較為嚴重。選用不同的掩蔽劑進行試驗，結果表明，4.0mg/ml NaF加入1.0ml可掩蔽10倍Fe3+，20倍的Al3+；1.0%的硫代硫酸鈉溶液1.0ml掩蔽銅效果較好，可不經分離直接測定發樣中痕量鋅。

2.9 樣品分析

取適量人發洗凈后，放入丙酮液浸泡12h，然后沖洗，放入烘烤箱在45℃～50℃烘干，冷卻后稱取0.2000g頭發在電爐中低溫炭化再放入馬弗爐（780℃）中灰化2h，取出冷卻至室溫，加入2ml HNO3（2mol/L）溶解殘渣，轉移于50ml小燒杯中，用水洗滌坩堝數次，用氨水（2mol/L）調至中性，最后轉移于50ml容量瓶中用去離子水定容。

取2.0ml樣品溶液于10ml比色管中加入1.0ml NaF（4.0mg/ml），1.0ml Na2S2SO3（1.0%），按照實驗方法測定，并做標準加入回收試驗，結果見表1。

參考文獻：

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[7] 賀元文， 呂昌銀， 楊柳青. 曙紅Y-PAN能量轉移熒光猝滅法測定痕量錳（Ⅱ）[J]. 中國衛生檢驗雜志， 2009， 19（1）： 103-105.

作者簡介：

賀元文（1980-），女，碩士研究生，主管檢驗師，主要從事臨床檢驗研究。