體細(xì)胞突變?cè)谙到y(tǒng)性紅斑狼瘡的自身抗體產(chǎn)生中的作用

石彬　姚新生

【摘 要】系統(tǒng)性紅斑狼瘡是最經(jīng)典的慢性自身免疫性疾病，該病患者血清中存在多種自身抗核抗體。然而這些自身抗體的產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多方面因素。體細(xì)胞突變便是諸多因素中的一個(gè)，由于目前國內(nèi)有關(guān)體細(xì)胞突變與自身抗體關(guān)系的綜述甚少，本文借此機(jī)會(huì)就這方面的研究狀況作一概述，旨在更好地理清體細(xì)胞突變與SLE自身抗體產(chǎn)生的關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】系統(tǒng)性紅斑狼瘡；體細(xì)胞突變；高頻突變；抗dsDNA；生發(fā)中心

【中圖分類號(hào)】R593. 241 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）02-0872-02

1 引言

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種病因未知的全身性自身免疫性疾病。在SLE患者血清中存在多種自身抗體，能結(jié)合dsDNA、RNA、染色體、RNA結(jié)合蛋白和磷脂。其中，具有診斷價(jià)值的自身抗體包括抗dsDNA、抗SM和抗心磷脂抗體?？筪sDNA是在SLE中研究得最多自身抗體，其產(chǎn)生與人類SLE疾病和小鼠自身性狼瘡樣腎炎相關(guān)。抗dsDNA常被發(fā)現(xiàn)于腎臟沉積，并且可以從腎臟洗脫。早期研究已證明，小鼠和人類單克隆抗dsDNA均可以通過過繼轉(zhuǎn)移到正常小鼠引起蛋白尿。然而，抗dsDNA在腎小球沉積的機(jī)制仍不清楚。

2 體細(xì)胞突變發(fā)生于抗dsDNA 的VH和VL區(qū)

第一個(gè)在分子細(xì)節(jié)上分析的抗DNA的抗體是IgM型抗DNA，是從健康的人和鼠中分離得到的。IgM型抗DNA屬于天然抗體庫，具有多反應(yīng)性。這些IgM型抗體是由V區(qū)缺乏體細(xì)胞突變的免疫球蛋白可變區(qū)基因的重鏈（VH）和輕鏈（VL）編碼而產(chǎn)生的。早期不成熟的B細(xì)胞庫里有高達(dá)50%的不成熟B細(xì)胞表達(dá)針對(duì)自身核抗原的多反應(yīng)性受體。絕大多數(shù)的多反應(yīng)性和自身反應(yīng)性克隆會(huì)在B細(xì)胞發(fā)育的兩個(gè)不同耐受檢查站被清除。盡管如此，在初始細(xì)胞庫里仍有約6%的子集存在多反應(yīng)性。另人意外的是，來自健康人受試者的IgG記憶B細(xì)胞也顯示了很高的多反應(yīng)性[1]。目前，仍不清楚的是，這群多反應(yīng)性的B細(xì)胞能否代表高親和力的抗dsDNA B細(xì)胞的前體。

與這些天然抗體的VH和VL序列分子分析相比，來源于鼠狼瘡模型和SLE患者的抗dsDNA的系統(tǒng)性分析揭示了所有這些抗體都出現(xiàn)了體細(xì)胞高頻突變的跡象。研究表明，在MRL/lpr小鼠中，可能先形成RF B細(xì)胞，不久后轉(zhuǎn)變成抗dsDNA B細(xì)胞[2]。在所有已分析的雜交瘤中，一個(gè)人SLE來源的雜交瘤抗dsDNA的限制性選擇實(shí)驗(yàn)證明了VH和VL區(qū)存在體細(xì)胞突變現(xiàn)象[3]。

3 抗dsDNA的體細(xì)胞突變模式

抗dsDNA的體細(xì)胞突變模式在過去已被深入地分析。一般認(rèn)為，在狼瘡鼠和SLE患者抗dsDNA的V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）上觀察到高頻率的置換突變提示抗原驅(qū)動(dòng)了抗dsDNA的選擇過程。在抗dsDNA的B細(xì)胞中，高頻率的體細(xì)胞的置換突變將導(dǎo)致產(chǎn)生更多的精氨酸（R）、賴氨酸（K）和天冬酰胺（N），這些氨基酸非常有利于調(diào)節(jié)帶負(fù)電的磷酸二酯鍵和dsDNA的堿基配對(duì)的相互作用。另外，在抗dsDNA重鏈的框架3區(qū)（FR3）位點(diǎn)76處會(huì)頻繁出現(xiàn)體細(xì)胞突變來源的R殘基，提示該結(jié)構(gòu)域在dsDNA結(jié)合方面起著顯著作用。R殘基出現(xiàn)于抗dsDNA也可由VH-D-JH和 VL-JL重排時(shí)CDR3區(qū)的連接多樣性而產(chǎn)生。此外，非常規(guī)的機(jī)制也可以參與這個(gè)過程，包括閱讀框3中D基因的使用、D基因倒置以及D-D融合。

R殘基對(duì)于dsDNA結(jié)合的重要性已用VH3H9鏈進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，該鏈?zhǔn)荕RL /lpr小鼠來源的抗dsDNA H鏈的一個(gè)原型。在H-CDR2區(qū)一個(gè)R殘基的反轉(zhuǎn)幾乎會(huì)消除其對(duì)dsDNA的結(jié)合，然而在這些區(qū)域出現(xiàn)由體細(xì)胞突變轉(zhuǎn)換的精氨酸時(shí)能顯著增加其對(duì)dsDNA的親和力[4]。加之，幾個(gè)R殘基的引入也能增加抗dsDNA對(duì)dsDNA的親和力，這表明R殘基對(duì)抗dsDNA起著增強(qiáng)劑的作用。同時(shí)，體細(xì)胞突變轉(zhuǎn)變的R殘基亦能影響人源單克隆抗體對(duì)組蛋白、SmD和RO等自身抗原的結(jié)合。

4 自身反應(yīng)B細(xì)胞的高頻突變發(fā)生于GC內(nèi)

抗dsDNA和多數(shù)其他抗核自身抗體非常類似于由針對(duì)病毒或半抗原的T細(xì)胞依賴性再次免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體。由于體細(xì)胞突變和T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)中的抗原選擇都發(fā)生于生發(fā)中心（GC），這讓人很容易推測(cè)，在SLE和鼠狼瘡中的抗dsDNA也來源于GC反應(yīng)中。然而，研究卻意外發(fā)現(xiàn)，在MRL/lpr小鼠的T細(xì)胞區(qū)-紅髓交界的濾泡外圍特定位置，自身反應(yīng)性B細(xì)胞可以進(jìn)行活躍的高頻突變[5]。最近，有一項(xiàng)自身免疫的FcgRIIB缺陷小鼠GC B細(xì)胞的深入分析顯示，表達(dá)GC標(biāo)志物的體細(xì)胞突變來源的B細(xì)胞顯著地富集于抗核自身抗體[6]。這些結(jié)果支持另一個(gè)觀點(diǎn)，即自身反應(yīng)B細(xì)胞的高頻突變發(fā)生于GC內(nèi)。然而，實(shí)際表達(dá)GC標(biāo)志物的B細(xì)胞卻位于GC外。當(dāng)前，這些濾泡外圍特定位置在體細(xì)胞突變和抗原選擇的抗dsDNA B細(xì)胞的進(jìn)化中的作用仍不清楚。

5 抗核自身抗體來源于體細(xì)胞突變后的非自身反應(yīng)B細(xì)胞

為了研究體細(xì)胞突變對(duì)于抗dsDNA進(jìn)化的意義，有學(xué)者做了3種來源于高活動(dòng)性SLE患者的抗dsDNA雜交瘤的分析[7]。分析清楚地表明，對(duì)dsDNA和核小體高親力需要一個(gè)逐步方式的置換突變才能實(shí)現(xiàn)[7]。IgG抗dsDNA雜交瘤的體細(xì)胞突變對(duì)于dsDNA結(jié)合的親和力是必要的。而對(duì)于高親合力的獲得，R、N和L殘基通常是最重要的，但在少數(shù)情況下，H-CDR1區(qū)的谷氨酸殘基卻變成了必要條件，這說明SLE自身抗體與dsDNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)上的先決條件是極其復(fù)雜的。更重要的是，3種抗dsDNA的在回復(fù)突變?yōu)榕呦祷蚝螅瑢?dǎo)致之前檢測(cè)到結(jié)合的任何dsDNA或ssDNA都不能被再次檢測(cè)[7]。這些結(jié)果被一項(xiàng)關(guān)于兒童SLE患者的抗ENA自身抗體的分析研究進(jìn)一步驗(yàn)證[8]。抗ENA B細(xì)胞的胚系形式幾乎完全失去了對(duì)ENA的結(jié)合能力?？箻蛄Ｐ咎堑鞍自趯こＰ吞彀挴徎颊咦裱瑯拥脑瓌t，即回復(fù)突變處理的自身抗體會(huì)喪失對(duì)自身抗原的反應(yīng)性。然而，這些分析不能排除H-CDR3區(qū)體細(xì)胞高頻突變的作用，它是由末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TDT）引入非模板核苷酸時(shí)而產(chǎn)生的。而且，研究顯示，TDT缺陷自身免疫小鼠的抗核抗體幾乎完全來源于通過體細(xì)胞高頻突變而獲得自身反應(yīng)性的非自身反應(yīng)B細(xì)胞[9]。

總之，這些研究足以證明一個(gè)結(jié)論：抗核自身抗體來源于發(fā)生體細(xì)胞突變的非自身反應(yīng)B細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于SLE中B細(xì)胞耐受機(jī)制的理解具有重要意義。因?yàn)榉亲陨矸磻?yīng)B細(xì)胞前體最不可能被中央耐受機(jī)制所影響，所以一直被視作正常B細(xì)胞庫的一部分。

6 GC反應(yīng)中高頻突變可以創(chuàng)造出抗dsDNA

AGC和AGT是絲氨酸的密碼子，在人和鼠抗體的VH和VL基因片段高頻出現(xiàn)。然而，在CDR1和CDR2 區(qū)的VH和VL基因片段，AGC和AGT的頻率分別高于隨機(jī)密碼子取用頻率4倍和8倍[9]。CDR1和CDR2 區(qū)高頻率的AGC和AGT可能是在進(jìn)化中代替突變熱點(diǎn)基序RGYW中的3個(gè)而保留下來的。RGYW熱點(diǎn)基序是在1992年首次被Rogozin 和 Kolchanow發(fā)現(xiàn)的，之后被證明是活化誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶（AID）的靶標(biāo)。顯然，高頻突變集中于熱點(diǎn)基序的方式對(duì)于保證GC反應(yīng)中抗體親和力的成熟是非常有利的。

然而，當(dāng)AGC/AGT密碼子每8個(gè)置換突變中出現(xiàn)4個(gè)突變?yōu)榫彼岷吞於０窌r(shí)，高頻突變就會(huì)使得抗體存在dsDNA結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)[9]。有報(bào)道稱，來源于非自身免疫個(gè)體的IgG 記憶B細(xì)胞在經(jīng)過高頻突變后具有較高頻率的自身反應(yīng)性[1]。在小鼠模型尤其是MRL/lpr小鼠，AID在自身抗體和狼瘡腎炎的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。AID缺陷的MRL/lpr小鼠具有明顯高的生存率[10]，甚至AID雜合MRL/lpr小鼠都顯示了高親和力致病性抗體產(chǎn)生的延緩[11]。此外，上調(diào)MRL/lpr小鼠GC中的AID的表達(dá)，將出現(xiàn)突變頻率的顯著增加，導(dǎo)致廣泛的核苷酸插入和刪除。這種突變的顯著性改變可能會(huì)進(jìn)一步增加GC中抗dsDNA的產(chǎn)生?？傊?，這些研究說明，在GC反應(yīng)中高頻突變可以創(chuàng)造出抗dsDNA。

7 總結(jié)與展望

實(shí)際上，SLE中的自身抗體的形成是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，是遺傳易感性和細(xì)菌或病毒感染等多因素共同作用下的結(jié)果。如前文所論述的，自身抗體，尤其是抗dsDNA很可能是GC反應(yīng)中的副產(chǎn)物。在自身免疫病中，自身反應(yīng)性抗體的特異性的形成是否是一個(gè)持續(xù)性過程是一個(gè)值得關(guān)注的問題，這將對(duì)于干預(yù)性治療的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)作用。如果這是一個(gè)持續(xù)性過程，未來可以考慮研究靶向GC反應(yīng)的新型治療制劑。而最近有研究指出，僅少數(shù)或單一的事件或可以誘導(dǎo)SLE自身反應(yīng)克隆的產(chǎn)生[12]，如果這個(gè)假設(shè)成立，自身反應(yīng)中的記憶細(xì)胞和漿細(xì)胞應(yīng)當(dāng)作為更好的治療靶標(biāo)。隨著這些存在爭論的問題的解決和SLE發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，更多更好的治療策略將會(huì)造福人類社會(huì)。

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