一種在豌豆植物中瞬時表達外源蛋白的新方法

范亞軍 倪秀珍

摘要：以豌豆植物為實驗材料建立了一種瞬時表達外源蛋白的新方法一發芽種子真空侵染法。以綠色熒光蛋白作為報告基因對該體系進行優化的結果表明其最佳工作條件為：菌體工作液濃度OD600=1.0～1.5，真空壓力0.08MPa，真空侵染時間1min。該方法操作簡單，可以同時侵染大量的豌豆植物材料，并將實驗周期縮短為15d，植物侵染后12～14d可收獲外源蛋白，外源蛋白表達量與葉片注射法相當，是一種在豌豆植物中批量生產外源蛋白的新方法。

關鍵詞：豌豆；瞬時表達；發芽種子；真空侵染

中圖分類號：Q819

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）03-0218-04

豌豆植物早褐病毒（pea early browning virus，PEBV）是一種寄生在豌豆植物體內的雙鏈RNA病毒，其中一條RNA鏈負責編碼病毒外殼及與線蟲傳播相關的蛋白，而另外一條RAN鏈編碼的蛋白則與病毒的移動和復制有關。目前經過人工改造的豌豆早褐病毒載體是一種研究豆科植物基因功能及在豆科植物中瞬時表達外源蛋白的有效工具[1]。利用植物體瞬時表達外源重組蛋白是植物生物反應器的一個重要研究方向，該體系外源蛋白表達量高，實驗周期短，而且具有相對操作簡單的優勢，但整體來看接種方式是影響該體系實驗效率的一個關鍵因素[2～5]。傳統的接種方式主要有摩擦接種法、葉片注射法和離體植物組織真空侵染法[4～12]，其中摩擦接種法是將含有重組基因的載體在體外轉錄，并通過機械方式在植物葉片上制造傷口，然后以轉錄產物涂抹或噴灑于植物葉片上進行接種，該方法操作相對比較繁瑣，實驗費用較高[4]。目前常用的離體植物組織真空侵染法主要是利用真空壓力對離體的植物組織如葉片等進行接種，此方法操作簡單，但是在收獲外源蛋白之前保持離體組織的新鮮度具有一定難度[5]。葉片注射接種法是在活體植物葉片上進行，要求植物具有2～3片展開的葉片，目前此種方法比較常用。利用葉片注射法已經成功在豌豆植物中表達了綠色熒光蛋白及其他重組蛋白[6，7]，但是在實驗操作中發現此種接種方式很難實現在植物中批量的生產外源重組蛋白，在此基礎上本研究建立了一種高效地在豌豆中批量表達外源蛋白的新方法即發芽種子真空侵染法，并對此種新的實驗體系進行了優化，實驗結果表明發芽種子真空侵染法與葉片注射法外源蛋白的表達量相當，但是發芽種子真空侵染法縮短了實驗周期，可以批量侵染實驗材料，是一種產業化生產外源蛋白的新方法。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1質粒、菌株、抗體及植物材料

農桿菌GV3101由本實驗室保存，豌豆早褐病毒表達載體pCAPE2-GFP和pCAPEI由丹麥農科院惠贈，豌豆植物品種為矮秧豌豆（Pisumsativum L.）。綠色熒光蛋白抗體、Rubisco大亞基抗體由東北師范大學遺傳所制備并提供。

1.1.2試劑

實驗過程中所用抗生素利福平、卡那霉素、四環素及乙酰丁香酮均購自北京鼎國生物技術有限公司，DNA2000 Marker、蛋白質低分子質量Marker購自日本TakaRa公司，蛋白質雜交所用二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG，購自北京中山生物技術有限公司。

用來鑒定豌豆早褐病毒載體pCAPE2-GFP的引物為：5'-CGGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTT-TT-3'5'-GGGGTACCTTATTTGTATAGTTCATCCATG-C-3'

用來鑒定pCAPEl載體的引物為：5'-CGTTAGATTGCGCTGTGG-3'5'-TGCCTTTGCTACGAACCT-3'

以上引物由上海生物工程有限公司合成。

實驗過程中所用菌體重懸液各成分：100μmol/L乙酰丁香酮、10mmol/L NaCl、1.75 mmol/L CaCl、250μL Tween 20、pH5.6的無菌水溶液。蛋白質提取緩沖液各成分（1L）：KC1 0.2g、NaCl 8g、KH2PO40.27g、Na2HPO4 1.42g、pH7.4。

1.2方法

1.2.1豌豆早褐病毒載體的鑒定

分別以豌豆早褐病毒載體pCAPE2-GFP和pCAPEl為模板進行PCR鑒定，PCR反應條件為94℃預變性3min； 94℃50s，50℃ 50s.72℃50s，33個循環；72℃ 8min。反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2菌種工作液及植物材料的處理

將豌豆早褐病毒載體分別轉入農桿菌GV3101中，在含有卡那霉素（50mg/L）、利福平（50mg/L）和四環素（25mg/L）的液體LB培養基中常規培養，當OD600值為0.8～1.0時收集菌體并以菌體重懸液調節菌體工作液濃度，將含有兩種載體的農桿菌按濃度比1：1混合后于室溫靜置90min備用。將豌豆種子在清水中浸泡4～5h，當種子吸水膨脹后置于28℃恒溫培養箱中催芽培養，芽長為1～2cm的豌豆種子置于上述菌體工作液中進行真空侵染。

1.2.3豌豆發芽種子真空侵染體系的建立及優化

本研究選擇真空處理時間、菌體工作液濃度及真空壓力3個因子對該體系進行優化，實驗過程中以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達率（表達綠色熒光蛋白的植株占總株數的比率）來評價該體系的工作效率，實驗設置3次重復，每次處理種子數目不少于20粒，結果取平均值。

1.2.3.1真空壓力對工作效率的影響

在菌體工作液濃度（OD00=1.0～1.5）和真空處理時間（1min）恒定的條件下選擇真空壓力分別為：0.02、0.04、0.06、0.08MPa對發芽的豌豆種子進行真空侵染，侵染后播種于土壤中，幼苗出土后紫外燈下跟蹤綠色熒光蛋白的表達情況并記錄。

1.2.3.2真空處理時間對工作效率的影響

在真空壓力（0.08MPa）和菌體工作液濃度（OD00=1.0～1.5）恒定的條件下選擇真空處理時間分別為：1、10、15min對豌豆種子進行真空侵染，侵染后播種于土壤中，幼苗出土后紫外燈下跟蹤綠色熒光蛋白的表達情況并記錄。

1.2.3.3菌體工作液濃度對工作效率的影響

在真空壓力（0.08MPa）和真空處理時間（1min）恒定的條件下選擇菌體工作液濃度分別為：OD600=0.3、0.6、0.9、1.2、1.5對豌豆種子進行真空侵染，侵染后播種于土壤中，幼苗出土后紫外燈下跟蹤綠色熒光蛋白的表達情況并記錄。

1.2.4發芽種子真空侵染法與葉片注射法的比較

選擇相同的菌體工作液濃度，分別采用葉片注射法及發芽種子真空侵染法進行接種，紫外燈下跟蹤觀察GFP的表達情況并拍照記錄。在外源蛋白表達高峰期分別收集可溶性總蛋白，15%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳后轉膜，并以Rubisco大亞基作為內參，以GFP抗體檢測外源蛋白質的表達情況。

2.2實驗結果

2.2.1豌豆早褐病毒載體的PCR鑒定結果

豌豆早褐病毒的兩個載體同時接種植物才能完成正常的侵染工作，通過PCR法對pCAPE2-GFP載體上的GFP基因片段和pCAPEI上的特異片段進行鑒定，實驗結果呈陽性，結果如圖1所示。

2.2.2發芽種子真空侵染體系的優化

侵染后在紫外燈下跟蹤觀察GFP的表達情況（從CFP開始表達連續跟蹤觀察15d），雖然真空處理的時間不同，但是GFP的表達率及表達趨勢基本一致，均是在真空侵染一周后（豌豆幼苗出土）綠色熒光蛋白開始表達，隨后GFP表達率升高，在侵染后第12～14d時表達率能達到90%，結果如圖2A所示。實驗發現真空壓力的大小是影響實驗體系工作效率的重要因素，在侵染時間及工作液濃度一致的條件下，真空壓力為0.02MPa時幾乎沒有植株表達綠色熒光蛋白，隨著真空壓力增大GFP表達率增高，在0.08MPa時GFP表達率最高，實驗結果如圖2B所示。

菌體工作液濃度是影響體系工作效率的另一個重要因素，實驗結果表明GFP的表達率隨著菌體工作液濃度的增大而升高，當菌體工作液濃度為OD600=0.9～1.5時有90%的豌豆植株表達綠色熒光蛋白，實驗結果如圖2C所示。

2.2.3發芽種子真空侵染法與葉片注射法的比較

實驗中以相同的菌體工作液分別采用了真空侵染法及葉片注射法進行接種，接種后跟蹤觀察GFP表達情況，兩種方法均在接種后第8d開始表達綠色熒光蛋白，真空侵染法的植物材料出土后植物莖最先表達綠色熒光蛋白，隨后出現在新生葉片的主脈和側脈，在侵染后12～14d時GFP在葉肉中大量表達并擴散；葉片注射法的植物材料綠色熒光蛋白首先在注射的葉片中開始表達，隨后擴散至鄰近的主莖中并相繼出現在鄰近及新生葉片的主脈和側脈，侵染后12～14d GFP在葉肉中大量表達，如圖3所示。

12～15d時提取豌豆植物可溶性總蛋白，以Rubisco大亞基作為內參通過蛋白雜交法比較兩種接種方法外源蛋白的表達量，實驗結果如圖4所示，Rubisco大亞基雜交結果表明各泳道（5～7）植物蛋白質上樣量基本一致，GFP雜交結果表明兩種接種方法外源蛋白的表達量相當。

3討論

利用植物瞬時表達外源蛋白最主要的優勢是操作簡單、實驗周期短及外源蛋白表達量高，目前已有的幾種接種方式各有利弊，本研究以豌豆植物為實驗材料建立了一種新的接種方式，菌體工作液濃度OD600=1.0～1.5時0.08MPa真空處理1min為該體系的最適條件，真空壓力及菌體濃度是影響該實驗體系的關鍵因素，當真空壓力及菌體工作液濃度很低時幾乎沒有GFP表達，隨著壓力及工作液濃度升高GFP表達率增加，當真空壓力為0.08Mpa，菌體工作液濃度為OD6oo=1.0～1.5時有90%以上的豌豆植株表達綠色熒光蛋白。該方法與常用的葉片注射法進行比較：葉片注射法在接種前需要豌豆植物具有2～3片完全展開的葉片（播種后2～3周），接種時需要逐株逐個葉片進行接種，而豌豆發芽種子真空侵染法直接以發芽的豌豆種子為材料進行侵染，可以在同一時間內批量地進行接種；葉片注射法獲得外源蛋白的周期約為30d，而發芽種子真空接種法獲得外源蛋白的實驗周期約為15d；兩種方法均是在侵染后12～14d外源蛋白表達量最高，蛋白質定量分析結果表明二者外源蛋白表達量相當，通過兩種不同接種方式的比較我們認為發芽種子真空侵染法是一種可以批量在豌豆植物中快速表達外源蛋白的新方法。

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