南高叢藍莓奧尼爾快速增殖的研究

陳冰心 劉奇暢 鄧喜艷 黃雄軍 劉如石 邱義蘭

摘要：為了探討南高叢藍莓奧尼爾快速增殖的條件，以奧尼爾無菌苗幼嫩莖段為試驗材料，對增殖培養和葉片再生條件進行研究。結果表明，WPM（改良）+0.5～1.0mg/L ZT的增殖培養基能使增殖系數提高到5以上，且叢生苗生長健壯和生長速度快；降低鹽濃度和添加玉米素是誘導葉片再生的關鍵：未切全葉的再生誘導優于切斷葉片，前者在1/2WPM+2.0mg/L ZT的培養基中的再生率高達71.4%，且主要形成具有2～4個芽的簇生苗。因此，將最佳的增殖培養和葉片再生相結合，使南高叢藍莓奧尼爾可持續快速增殖，為進一步獲得優良的奧尼爾種苗及其工廠化生產奠定重要基礎。

關鍵詞：南高叢藍莓；奧尼爾；增殖；葉片再生

中圖分類號：S663.9

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）03-0246-04

藍莓屬杜鵑花科（Ericaeae）越桔亞科（Vaccin-ioideae）越橘屬（Vaccinium）。藍莓果實富含花青素、不飽和脂肪酸、鞣酸及鈣、鉀、鋅、鐵等元素，B族維生素含量尤為突出，被國際糧農組織列為五大健康食品之一，堪稱世界水果之王，是近幾年來發展最迅速的集營養與保健于一身的第3代果樹品種[1～4]。近幾年來，藍莓鮮果和加工品風靡歐美等發達國家市場，雖然價格昂貴但仍供不應求，其傳統的北美產區的產量已遠不能滿足本地和世界市場的需求，為此世界上其他國家已先后引種。我國有著可以生產藍莓的廣闊天地，南方紅黃壤土地面積達2179600km2，占全國土地面積的22%，其中2040000km2土壤屬酸性，而且很大一部分pH<5.0[5]，由于土壤酸度大和肥力不足，農業生產水平較低。藍莓特別適合酸性和強酸性土壤，正是紅黃壤地區脫貧致富的理想作物。

隨著我國南方對藍莓引種栽培規模日益擴大，優良種苗需求量急劇增加，種苗生產供不應求。組織培養憑借其無性繁殖的獨特優勢，可以迅速去除病毒和更新品種，保留品種的本來特性，變異性小，并且可在較小空間內和較短時間內快速地獲得大量無性系組培苗，成為藍莓脫毒和快速繁殖的主要途徑。到目前為止，國內外對藍莓組織培養進行了大量的研究，但大多尚處于微繁階段，對離體誘導不定芽再生植株的報道較少。有關藍莓離體葉片再生的研究表明，影響藍莓離體器官再生的影響因素很多，其中植物激素起決定性的作用，藍莓葉片再生受基因型的限制，不同藍莓品種再生條件及再生頻率存在差異[6～10]。奧尼爾（O'Neal）為南高叢藍莓的代表品種之一，果實大粒、蒂痕小、果粉較少、果肉質硬耐儲運、豐產、香味濃，在南高叢藍莓品種中香味評價較高，適宜在我國長江流域大部分地區種植。有關奧尼爾離體葉片再生及快速繁殖的研究尚未見報道。因此，我們將增殖培養和葉片再生條件優化，獲得奧尼爾快速持續增殖的關鍵技術，為建立適宜于藍莓奧尼爾苗木的工廠化育苗和商品基地建設奠定堅實基礎。

1材料與方法

1.1材料

植物材料為智博生物科技公司種植園種植的南高從藍莓品種奧尼爾（O'Neal）無菌苗。

1.2方法

1.2.1增殖培養

將無菌苗切成單芽莖段后轉接于不同激素濃度的WPM[11]（改良）培養基（各處理激素濃度組合見表1）+20g/L蔗糖+8.8g/L日產瓊脂粉的增殖培養基（pH=5.2）中進行光照培養，培養40d后觀察芽的生長狀況和計算增殖系數。光照培養條件為：溫度25+2℃，光強2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗，下同。WPM培養基具體改良方法：以Ca（NO3）2·4H2O、KNO3分別代替原WPM培養基中的CaCl2、K2SO4。增殖系數=增殖芽總數/接種單芽莖段總數。

1.2.2葉片誘導再生

選取增殖培養的無菌苗植株第3～6節葉片，3種外植體包括未切全葉、離葉尖端的1/3處橫切葉片形成的葉尖端葉片和葉柄端葉片，均按照背面朝下分開放置接種于不同鹽濃度（各處理鹽濃度見表2）和不同ZT濃度（各處理ZT濃度見表3）的WPS（改良）培養基+20g/L蔗糖+9g/L瓊脂粉（pH=5.2）的培養瓶內，每瓶各10片左右，每個處理重復12瓶。先進行20d的暗培養（溫度25±2℃），隨后進行光照培養。30d后統計葉片出芽率及每個葉片相應形成的苗數。

2結果與分析

2.1增殖培養

將無菌苗切成單芽莖段轉接到不同激素濃度的增殖培養基上進行優化，結果見表1。從表1可以看出，ZT的增殖效果明顯優于6-BA和TDZ，且不定芽的發生率與培養基中的ZT濃度有密切的關系。當ZT質量濃度為0.5mg/L時，培養10d左右在莖基部產生黃綠色的愈傷組織，葉節處出現叢生芽，28d后增殖系數達到5.02，且主要為主枝芽，叢生芽粗壯，生長勢頭好，呈鮮嫩狀。當ZT質量濃度升高到1mg/L時，開始生長和分化的時間與ZT 0.5mg/L時相差不大，其增殖系數稍有所增加。當ZT質量濃度等于或大于2mg/L時，再生苗開始生長和分化現象提前，多數分化出來的新梢枝上出現2次分枝，增殖系數達到10左右，由于側枝芽多使苗長勢較弱易出現玻璃化苗現象。WPM與其它激素組合效果均差于WPM+ZT組合。使用6-BA時，外植體不萌芽生長，生長停滯。使用TDZ時，10d后在外植體基部形成少量愈傷，雖然能萌芽，但萌芽率低且生長緩慢。因此，增殖培養基以WPM+0.5～1.0mg/L ZT為適宜。

2.2葉片誘導再生

2.2.1鹽濃度對葉片再生誘導的影響

離葉尖1/3處橫切葉片成葉尖端部分和葉柄端部分，以及未切全葉，均按照葉片背面朝下接種于含有不同鹽濃度的培養瓶內，30d后統計葉片再生率，結果見表2。從表2中可以看出，高鹽濃度不利于葉片的再生，其誘導再生苗率僅為0%～2.7%。將大量元素濃度減少一半，能明顯促進葉片的再生，葉片誘導再生苗率提高至23.1%～70.9%。在葉片不同部位中，葉尖端的再生苗誘導率最低，葉柄端居中，未切全葉的誘導率最高。

2.2.2不同激素濃度對葉片誘導再生的影響

不同激素濃度對葉片不同部位的再生苗誘導效果不同。TDZ不能誘導葉片形成再生苗，葉片培養10d后在切口處形成愈傷組織，隨著培養時間的延長，愈傷組織慢慢褐化，未見再生苗形成。ZT對葉片再生苗誘導效果明顯優于TDZ，不定芽的發生率與培養基中的ZT有密切的關系。不同部位葉片的再生苗誘導率存在明顯差異，葉尖端的誘導率最低，葉柄端的居中，全葉的誘導率最高（表3）。ZT對葉片再生苗誘導存在明顯的濃度效應，低濃度ZT主要誘導形成單生苗，而高濃度ZT有利于簇生苗的形成（表3，圖1A～D）。葉尖端葉片誘導的再生苗主要形成于切口處，葉柄端和全葉誘導的再生苗主要形成于葉柄一側。葉尖端在0.5mg/LZT時誘導率為0，隨著ZT濃度的升高誘導率逐漸增加，在5mg/L ZT時的誘導率達到32.3%；葉柄端和全葉的誘導率均隨ZT質量濃度的升高逐漸增加，在2.0mg/L ZT時誘導率均達到最高，葉柄端和全葉的再生苗誘導率分別為54.3%和71.4%，5mg/LZT時的誘導率卻均下降（表3，圖1A～D）。綜合以上結果，選用全葉進行葉片再生苗誘導，其再生苗誘導的最佳ZT質量濃度為2.0mg/L。

3討論

已有研究表明，藍莓快繁的培養基以WPM的效果最好[6]，且在芽的誘導和增殖中細胞分裂素的作用至關重要[7，10]。ZT是一種高活力的細胞分裂素，具有打破植株頂端優勢、促進腋芽萌發、誘導不定芽形成的作用。因此，我們主要采用了WPM培養基，重點探討了ZT的效應。本研究表明，利用0.5mg/L ZT進行增殖培養，增殖系數達到5以上，且叢生芽生長健壯，生長速度快，通過2～3次繼代，其增殖系數可達50—60；1mg/L ZT的增殖系數稍高于0.5mg/L ZT； ZT質量濃度大于等于2mg/L時增殖系數高達10倍左右，叢生苗太多生長速度慢，同時玻璃化現象的出現使有效苗數減少。由于ZT價格貴，從生產成本、增殖系數和苗的生長狀況進行綜合考慮，0.5mg/L ZT的增殖效果最佳。

葉片離體培養的相關研究證實了藍莓可通過器官發生途徑誘導再生植株[12～14]。本研究發現高叢藍莓奧尼爾葉片在高鹽濃度和單獨添加TDZ均不能誘導植株再生，降低鹽濃度和添加ZT是誘導葉片再生的關鍵因素；未切葉的誘導率優于切斷葉，在1/2 WPM+2.0mg/L ZT條件下完整葉的再生率最佳，高達71.4%，且主要形成具有2～4個芽的簇生苗。該結果與兔眼藍莓[16]和高叢藍莓[8，14～16，18]有關的誘導葉片植株再生的條件不同，表明藍莓葉片離體再生植株通過器官發生途徑可能因培養體系、品種等的不同而存在差異。本研究建立了高叢藍莓奧尼爾優良的繼代增殖培養體系和葉片再生體系，使之能陜速持續增殖，其增殖系數非常可觀，遠遠高于前人在高叢藍莓增殖研究中的結果[8，14～19]，為進一步建立適宜于藍莓奧尼爾苗木的工廠化育苗和商品基地建設奠定堅實基礎。

參考文獻（References）：

[1]CONNOR A M，LUBY J J，TONC C B S.Variability in antiox-idant activity in blueberry and correlations among diffferentantioxidant assays[J]. Journal of the American Socifety for Horti-cultural Science， 2002， 127（2）：238-244.

[2]CONNOR A M，LUBY J J，TONC C B S，et al.Genotypic andenvironmental variation in antioxidant activity， total phenoliccontent， and anthocyanin content among blueberry cultivars[J].Journal of the American Society for Horticultural Science，2002， 127（1）：89-97.

[3]LYRENE P M，VORSA N，BALLINGTO N R.Polyploidy andsexual polyploidization in the genus Vaccinium[J]. Euphytica，2003， 133（1）：27-36.

[4]HANCOCK J F，LYRENE P，FINN C E，et al.Blueberries andcranberries. In：Hancock J F（ed） Temperate Fruit Crop Breed—ing[M]. New York： Springer-Verlag Press， 2008.115-149.

[5]顧姻，王傳永，吳文龍，等.美國藍漿果的引種[J].植物資源與環境學報（GU Yin， WANG Chuan-yong， WU Wen-long，etal. Introduction of American blueberries[J]. Journal of PlantResources and Environment）， 1998， 7（4）：33-37.

[6]WOLFE D E，ECK P，CHIN C.Evaluation of seven media formicropropagation of highbush blueherry[J]. Hortscience， 1983.18（6）：703-705.

[7]SHARON G B，CHEE K.CHIN C.Regeneration Of blueberryplantlets from leaf segment[J]. Hortscience， 1988， 23（4）：763-766.

[8]陶建敏，耿其芳，莊智敏，等藍漿果葉片高效再生體系的建立[J].西北植物學報（TAO Jian-min， GENG Qi-fang， ZhUANGZhi-min， et al.Construction of the high-efficiency regenerationsystem of blueberry with its Ieaves[J]. Acta Botanica Boreali-Oc-cidentalia Sinica）， 2006， 26 （3）：610-614.

[9]孫陽，劉慶忠.3莓品種葉片離體再生及生根技術研究[J].安徽農業科學（SUN Yang， LIU Qing-zhong. Studies on theregeneration of leaf in vitro and rooting in three blueberry cul-tivars[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences）， 2008， 36（11）：4411-4412.

[10]LIU C， CALLOW P， ROWLAND L J， et al. Adventitious shootregeneration from leaf explants of southern highbush blueberrycultivars[J]. Plant Cell Tissue and Organ Cultural， 2010， 103（1）：137-144.

[11]LLOYD E， MCCOWN B H. Commercially feasible microprop-agation of mountain laurel， Kalmia latifolia， by use of shoot tipculture[C]// Combined Proceedings of Intemational Plant Prop-agalors's Society， 1980， 30：421-427.

[12]SONG G Q， SINK K C. Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation of blueberry （Vaccinium corymbosum L，） [J].Plant Cell Reports. 2004， 23（7）：475-484.

[13]CAO X， FORDHAM I， DOUGLASS L， et al. Sucrose level in-fluences micropropagation and gene delivery into leaves fromin vitro propagated highbush blueberry shoots[J]. Plant Cell Tis-sue and Organ Cultural， 2003， 75（3）：255-259.

[14]CAO X， HAMMERSCHLAG F A. Improved shoot organogene-sis from leaf explants of highbush blueberry[J]. Hortscience， 2000（5），35：945-947.

[15]CAO X，HAMMERSCHLAG F A，DOUGLASS L.A two steppretreatment significantly enhances shoot organogenesis fromleaf explants of highbush blueherry cv. Bluecrop[J]. Hortscience，2002，37（5）：819-821.

[16]ROWLAND L J，OCDEN E L.Use of a cytokinin conjugatefor efficient shoot regeneration from leaf sections of highbushblueberry[J]. Hortscience， 1992， 27（10）：1127-1129.

[17]邱義蘭，陳冰心，鄧喜艷，等，兔眼藍莓組織培育苗高效快繁技術[J]湖南師范大學自然科學學報（QIU Yi-lan， CHENBing-xin， DENG Xi-yan，et al.Efficient propagation technology of tissue culture seedlings of Vaccinium Ashei Reade[J].Journal of Natural science of Hunan Normal University）， 2013，36（1）：68-74.

[18]崔廣榮，陸峰，曹華龍，等.藍莓離體葉片胚狀體高效發生及其組織學觀察[J]激光生物學報（CUI Guang-rong， LU Feng，CAO Hua-long，et al.High efficient somatic embryogenesis onleaf explants of blueberry in vitro culture and histological ob-servations[J]. Acta Laser Biology Sincica）， 2008， 17（5）：599-607.

[19]王淑珍，來文國，周歷萍，等，南高叢藍莓組培再生技術研究[J].現代農業科技（WANG Shu-zhen， LEI Wen-guo， ZHOU Li-ping，et al.Studies of regeneration technique of tissue cultureon southern high blueberry[J]. Modern Agricultural Science andTechnology）， 2011， （21）：119-120.