端粒和端粒酶在癌癥中的研究進(jìn)展及意義
2014-04-29 15:34:27劉仲娜鐘金城柴志欣
生命科學(xué)研究 2014年3期
劉仲娜 鐘金城 柴志欣
摘要：端粒是位于染色體末端的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，對基因組穩(wěn)定性和完整性起保護(hù)作用。端粒的長度與細(xì)胞周期密切相關(guān)。其長度變化機(jī)制分為依賴端粒酶活性和端粒重組兩類，氧化應(yīng)激和鉛（Pb）與端粒酶的功能蛋白相結(jié)合抑制其活性，致使端粒縮短，硒（Se）與二者具有拮抗作用，延緩衰老。相關(guān)數(shù)據(jù)表明85%腫瘤細(xì)胞與端粒酶活性成正相關(guān)，以端粒酶活性作為腫瘤治療靶標(biāo)稱為當(dāng)代熱點之一。主要對肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤與端粒的相關(guān)性進(jìn)行了綜述，以期為端粒和端粒酶在癌癥治療研究提供參考依據(jù)。
關(guān)鍵詞：端粒；端粒酶；腫瘤
中圖分類號：Q754
文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A
文章編號：1007-7847（2014）03-0260-05
20世紀(jì)30年代，人們開始了解染色體上的一種特殊結(jié)構(gòu)——端粒。端粒是存在于真核細(xì)胞線狀染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成了特殊的“帽狀”結(jié)構(gòu)，維持染色體的完整和細(xì)胞活性，其實質(zhì)為一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。端粒與有絲分裂有著密切的聯(lián)系，細(xì)胞每分裂一次，端粒就縮短30～200bp，當(dāng)縮短到2～4kb，會導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制功能衰退，引起細(xì)胞衰老或死亡，被科學(xué)家稱為“有絲分裂時鐘”和“生命時鐘”[1，2]。端粒的延長和重組機(jī)制都是通過端粒酶來催化和介導(dǎo)的，端粒酶在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞活性和潛在的增殖能力等方面發(fā)揮重要作用。鑒于端粒酶在正常組織體細(xì)胞中的活性被抑制，而在腫瘤中則被重新激活，可能參與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制，成為醫(yī)學(xué)界研究的重點和熱點之一。2009年美國3位科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶結(jié)構(gòu)及其對染色體末端的保護(hù)功能，而獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。
1端粒和端粒酶
1.1端粒的結(jié)構(gòu)和功能
端粒是位于染色體末端由一個富含G的DNA串聯(lián)重復(fù)序列[3]和端粒結(jié)合蛋白組成，每個重復(fù)序列一般為5—7bp[4]。不同物種其重復(fù)序列存在l～2個堿基差異，哺乳動物的端粒重復(fù)序列為5'-（TTAGGG）n-3'[5]，植物的端粒重復(fù)序列為5'一（TTTAGGG）n-3'[6]。端粒長15～20kb，其重復(fù)序列成T環(huán)結(jié)構(gòu)，像帽子一樣能有效防止染色體間末端重組、融合和染色體退化[7]。末端復(fù)制問題是指真核生物線性染色體在復(fù)制過程中以RNA為起始引物，當(dāng)DNA聚合酶沿著5'到3'復(fù)制完成時，RNA被剪切，造成5'末端空缺，從而使5'末端序列縮短。端粒的形成填補(bǔ)了這一空缺，解決了“末端復(fù)制問題”，維持染色體末端的穩(wěn)定性和完整性。在正常體細(xì)胞中，端粒可隨著細(xì)胞分裂而逐漸縮短，當(dāng)縮短到一定程度，末端重復(fù)序列不能形成T環(huán)結(jié)構(gòu)，從而使編碼基因結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致染色體末端融合或降解，使細(xì)胞開始走向衰老、死亡。
1.2端粒酶的組成和功能
端粒酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白，在染色體末端能不斷合成端粒序列，具有維持端粒長度和細(xì)胞增殖的潛能，是一種自身攜帶模板的逆轉(zhuǎn)錄酶。RNA組分中含有與同源端粒DNA重復(fù)序列TTAGGG的互補(bǔ)序列，而蛋白質(zhì)組分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，以RNA為模板催化端粒DNA合成，將其加到端粒的3'端，以維持端粒結(jié)構(gòu)及功能。
人的端粒酶是由3個亞基組成[8]：RNA組分（hu-man telomere RNA，hTR）、端粒酶相關(guān)蛋白（telomerase associated protein）和端粒酶催化亞單位（逆轉(zhuǎn)錄酶組分，human telomerase reverse tran-scriptase，hTERT /hTRT/hEST2），其中催化亞單位位于染色體5P/5。33區(qū)，包括16個外顯子和15個內(nèi)含子，外顯子從104～8616不等。與一般基因結(jié)構(gòu)不同的是，在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)沒有典型的TATAbox或類似序列，卻有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點位于ATG上游，包括多個SPI（特異性β1糖蛋白）結(jié)合位點、c-myc（一個受特殊信號調(diào)節(jié)的可誘導(dǎo)癌基因）結(jié)合位點、AP2結(jié)合位點（脂肪連接蛋白2）。實驗研究表明6種端粒相關(guān)蛋白（TRF1、TRF2、TIN2、RAP1、POT1、PIPl）構(gòu)成端粒蛋白復(fù)合體稱為shelterin[9]， TRF1和TRF2與端粒雙鏈DNA結(jié)合，POT1結(jié)合在端粒單鏈DNA的3'懸突[10～13]，通過蛋白之間的相互作用，其他3種蛋白也與端粒相結(jié)合[14，15]。shelterin對端粒酶活性具有調(diào)節(jié)作用。hTR的存在也對端粒酶功能至關(guān)重要，影響其穩(wěn)定性與突變，改變體內(nèi)端粒長度，通過改變端粒完整性或結(jié)合因子的末端結(jié)合位點，使細(xì)胞分裂到后期死亡。hTRT/hESrr2是hTR依賴的DNA聚合酶，而hTERT是端粒合成的主要限速成分[16]，臨床上多以hTERT作為腫瘤治療的靶點。
2端粒長度的變化機(jī)制及影響因素
2.1端粒長度變化機(jī)制
Kakuos等[17]通過對恒河猴和其他非人類的靈長類動物做實驗，發(fā)現(xiàn)其端粒長度至少為23kb，而在人胃中發(fā)現(xiàn)小于10kb的端粒存在，說明同一祖先的不同物種之間端粒長度存在差異。也有實驗表明來自同一物種不同個體，不同組織雖然不具有物種特異性，卻有一定的相似性。例如A與B是來自同一個體的不同組織，A中的端粒長度大于B；那么在同一物種不同個體中的A與B比較，出現(xiàn)A中端粒長度大于B的比率大，但不保證一定出現(xiàn)。日前，已有科學(xué)家通過實驗驗證，雄性動物中的端粒長度普遍比同種雌性動物的短[18]，這可以從分子水平上解釋，在身體健康狀態(tài)相似，同等饑餓的條件下，女性存活時間大于男性，亦解釋女性壽命普遍長于男性。
端粒酶的活性不能使端粒的長度無限延長，當(dāng)達(dá)到自身穩(wěn)態(tài)時，它就會在此值上下浮動。目前科學(xué)家提出端粒長度的變化機(jī)制：一類是依賴端粒酶活性，如生殖細(xì)胞、成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞[19]；另一類是端粒重組，如淋巴細(xì)胞和胃黏膜細(xì)胞中有少量甚至沒有端粒，卻具有很長的壽命[20]。曾思聰?shù)萚21]研究表明在人類胚胎早期發(fā)育過程中，前期端粒長度的維持以重組為主要方式；發(fā)育后期端粒酶活性維持端粒在干細(xì)胞向各個胚層發(fā)育時的長度。
2.2影響端粒長度的因素
端粒長度變化影響了端粒的結(jié)構(gòu)和功能，端粒結(jié)構(gòu)和功能異常會導(dǎo)致很多疾病的產(chǎn)生。因此了解影響端粒長度的因素對預(yù)防和治療各種疾病尤為重要。
氧化應(yīng)激可以引起端粒長度的變化，在大多數(shù)細(xì)胞中，氧化應(yīng)激可以使端粒縮短，長久的氧化應(yīng)激在肝病及肝癌形成過程中起重要作用。為了抵抗氧化應(yīng)激微環(huán)境的影響，可適當(dāng)使用抗氧化劑。在正常體細(xì)胞中，抗氧化劑維持端粒酶的活性，防止端粒縮短，延緩細(xì)胞衰老；而在癌細(xì)胞中，抗氧化劑卻抑制端粒酶的活性，促進(jìn)端粒縮短，加速癌細(xì)胞的衰亡[22]。此外Masayuki等[23]研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育過程中父親精子中的端粒酶活性高，作用大，母親相對較弱，同時發(fā)現(xiàn)子代端粒長度與父親的年齡有關(guān)。
Shinobu Ukmori等[24]通過對粟酒裂殖酵母的研究發(fā)現(xiàn)，消除TRTl+會使端粒長度縮短，消除POTl+會造成端粒長度迅速的缺失，同時發(fā)現(xiàn)POT1（POT1與大多數(shù)端粒末端的單鏈DNA相連）和Rghl發(fā)生雙突變會產(chǎn)生致死因子，而TOT1和Rghl雙突變不會產(chǎn)生致死因子。不但闡明了基因間的相互影響，也為諸多腫瘤疾病的治療提供了理論參考依據(jù)。Harutake Yamazaki等[25]對裂殖酵母研究表明，Ccql蛋白發(fā)生突變（丙氨酸被93位的蘇氨酸所替代）使端粒酶供給不足導(dǎo)致端粒長度減小，但如果直接對Ccql蛋白中93位處的蘇氨酸磷酸化卻可以促進(jìn)端粒的延伸。同時Zhong Y等[26]實驗發(fā)現(xiàn)TPP1磷酸化可以延長端粒長度。研究證實酵母端粒結(jié)合蛋白Raplp與端粒長度成負(fù)相關(guān)。人與其相對的蛋白是TRF1和TRF2，但二者機(jī)制不同c27]： TRF1的表達(dá)使端粒酶有效結(jié)合端粒數(shù)量下降，而TRF2的表達(dá)則導(dǎo)致端粒酶降解。
有相關(guān)報道指出，Pb對DNA有損害作用，中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心生物技術(shù)實驗室也采用釀酒酵母做過相關(guān)的實驗[28]，通過測定釀酒酵母細(xì)胞活力、釀酒酵母細(xì)胞端粒長度、端粒酶活性以及端粒結(jié)合蛋白Raplp濃度等相關(guān)數(shù)據(jù)，表明Pb與端粒結(jié)合Raplp的羰基和胺基相互作用，使端粒結(jié)合蛋白Raplp的正常結(jié)構(gòu)被干擾不能被端粒正常識別，降低其保護(hù)作用。Se和Pb有一定的拮抗作用，可以形成蛋白復(fù)合物或者是鉛的結(jié)合位點發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而破壞了細(xì)胞對鉛的吸收和積累；Se對Pb產(chǎn)生的自由基有一定的清除作用，所以廣大女性應(yīng)減少彩妝的使用，減少Pb毒害，適量補(bǔ)充Se元素，延緩衰老。
3端粒酶在醫(yī)學(xué)上的研究
3.1端粒酶與腫瘤的相關(guān)性
正常體細(xì)胞沒有端粒酶活性，但永生化細(xì)胞系和超過85%的腫瘤細(xì)胞顯示端粒酶活性，以防止端粒逐漸縮短。已發(fā)現(xiàn)端粒酶的激活存在于人類各種腫瘤和腫瘤衍生的細(xì)胞系中，KheirollahiM等[29]對50例患者進(jìn)行端粒酶活性的檢測，其中包括26例腦膜瘤和星形細(xì)胞瘤患者，結(jié)果顯示，腦組織中端粒酶活性呈陽性的有39例（39/50=65%）；同時單樣本t檢驗表明，端粒酶活性在完全腦膜瘤、星形細(xì)胞瘤中的影響是顯著的（P
3.2腫瘤的診斷與治療
85%的腫瘤細(xì)胞存在端粒酶活性[32]以端粒酶活性作為腫瘤診斷的靶標(biāo)可增加腫瘤預(yù)知性。酶活性過度維持是誘發(fā)腫瘤的關(guān)鍵因素之一，國內(nèi)外的一些研究人員設(shè)想通過對端粒和端粒酶的研究可能揭示癌癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并設(shè)計基因診斷和基因治療等方案。用ELISA定量、實時熒光定量檢測婦科惡性腫瘤組織中的端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)婦科惡性腫瘤組織中端粒酶的活性明顯高于良性病變和正常組織。類似的結(jié)果也被發(fā)現(xiàn)在普通腦膜瘤、急性髓性白血病、膀胱癌腫瘤、乳腺癌等惡性腫瘤患者中。目前，以腫瘤中被激活的端粒酶為靶點，研制出治療室管膜細(xì)胞瘤的新藥物，并已在分離得到的室管膜細(xì)胞瘤細(xì)胞中證實了其功效。但并不是所有腫瘤都和端粒酶活性存在相關(guān)性，Zhang Y等[33]研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤（OS）細(xì)胞株利用端粒延長替代機(jī)制維持其長度，在此病治療時利用抗端粒延長替代機(jī)制可能比抗端粒酶活性更有效果。由于腫瘤組織多通過患者的診斷、治療才能獲得，直接取樣對患者來說創(chuàng)傷性大，且治療可能會影響組織的端粒長度，因此檢測腫瘤組織端粒長度預(yù)測腫瘤發(fā)生風(fēng)險的價值有限。如果采用腫瘤替代組織，如收集唾液、采取口腔細(xì)胞以及外周血，減少了其他人為因素對端粒長度的影響。然后通過定量PCR、熒光原位雜交（FISH）等技術(shù)準(zhǔn)確測量端粒的長度，以此來預(yù)測腫瘤的風(fēng)險性。
3.3最新研究發(fā)現(xiàn)
隨著分子生物學(xué)發(fā)展步伐的加快，人們發(fā)現(xiàn)癌癥致死的因素與端粒缺失密切相關(guān)，研究表明端粒的缺失可能存在4個因素：第一，在癌細(xì)胞中由于復(fù)制壓力導(dǎo)致脆性位點的雙鏈斷裂頻率上升；第二，端粒本身屬于脆性位點；第三，端粒近端區(qū)易發(fā)生雙鏈斷裂；第四，癌細(xì)胞中染色體不能完成自我修復(fù)。端粒縮短使細(xì)胞衰老或死亡。
近幾年在端粒研究方面取得了新的進(jìn)展。2007年A-T科學(xué)公司研制出以端粒為靶標(biāo)的TA-65營養(yǎng)補(bǔ)充片，其可以提高人的骨密度和免疫力，具有延緩衰老的作用.但如果過量服用卻增加了致癌風(fēng)險。2012年美國杜克大學(xué)基因組學(xué)與政策研究所對家庭暴力可能對兒童的DNA造成破壞并導(dǎo)致早衰進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，家庭暴力會使兒童染色體端粒縮短速度加快，與同齡人相比患心臟病的時間提前7～10年。同年芬蘭研究人員發(fā)現(xiàn)，超負(fù)荷和高壓力工作會使人體細(xì)胞中染色體端粒縮短，加快衰老。今年2月美國卡內(nèi)基一梅隆大學(xué)發(fā)現(xiàn)人類的感冒與一種特定類型的白細(xì)胞CD8CD28_T細(xì)胞的端粒長度相關(guān)，研究指出該細(xì)胞端粒越短越容易患感冒。利用熒光定量PCR和實時定量PCR對不同人群進(jìn)行端粒長度的測量，判斷是否是易感人群，可提前采取感冒預(yù)防措施。
4研究前景與展望
端粒縮短會造成DNA損傷、炎癥和氧化應(yīng)激等反應(yīng)。無論是引起心血管疾病的危險因素或是常見的心血管疾病，如動脈粥樣硬化、心臟衰竭、高血壓，都呈現(xiàn)白細(xì)胞端粒縮短。盡管端粒長度并不滿足作為人體衰老的唯一標(biāo)志，但如果結(jié)合實際年齡卻可以作為心腦血管老化的標(biāo)志，這對日后診斷心血管疾病提供參考依據(jù)。端粒酶與衰老的聯(lián)系也逐漸成為人們關(guān)注的焦點，衰老的發(fā)生是由衰老細(xì)胞的逐漸累積而引起，具體表現(xiàn)為細(xì)胞停止生長、端粒酶活性降低和端粒功能異常，其中端粒功能異常主要包括端粒縮短、端粒DNA損傷、端粒結(jié)構(gòu)異常。端粒酶活性激活，防止端粒在復(fù)制中不斷縮短，使細(xì)胞壽命得以延長。但過度維持端粒酶活性會導(dǎo)致細(xì)胞永生化，發(fā)生腫瘤病變。在以端粒酶的酶活性為靶標(biāo)研發(fā)新藥時，應(yīng)注意藥物劑量。
端粒和端粒酶結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)現(xiàn)是分子生物學(xué)發(fā)展的又一里程碑，不僅揭示了對染色體的保護(hù)作用，而且合理準(zhǔn)確地解釋了“末端復(fù)制問題”。其作為影響人類衰老和癌變的因素之一，給未來抗衰老及腫瘤治療等醫(yī)學(xué)難題指明了方向，提高治愈機(jī)率。但對其研究仍存在盲區(qū)，利用基因克隆及測序技術(shù)查找相關(guān)功能基因、結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測其結(jié)構(gòu)和功能、分析功能基因與端粒的相關(guān)性等方面仍有很多尚待發(fā)現(xiàn)的新突破。此外，shelterin復(fù)合體形成帽狀結(jié)構(gòu)對染色體的保護(hù)功能并十分不明確，可分別對6種蛋白進(jìn)行敲除來研究其代謝途徑，找出與其相關(guān)疾病的致病基因，利用藥物基因組學(xué)研發(fā)特異性高、毒副作用低、藥效好的藥物，以期為醫(yī)學(xué)研究作出重大的貢獻(xiàn)，同時也為后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)。
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