玉米轉(zhuǎn)獳BP9和ZmCBF3雙基因植株的獲得

趙學(xué)成 宗娜 趙軍

摘要 [目的]獲得轉(zhuǎn)雙基因的植株，研究植物逆境誘導(dǎo)基因ABP9和ZmCBF3的協(xié)同表達對玉米抗逆性的影響。[方法]通過農(nóng)桿菌侵染的方法將ABP9和ZmCBF3基因同時轉(zhuǎn)入玉米中，并對T0代植株進行分子鑒定。使用含有ABP9啟動子驅(qū)動ABP9和ZmCBF3雙基因載體的農(nóng)桿菌侵染玉米幼穗，獲得T0代種子；在田間通過對玉米苗噴灑草銨膦除草劑篩選獲得具有草銨膦抗性的玉米植株。[結(jié)果]挑選10株抗性玉米苗小量提取DNA并進行PCR擴增分析，其中5個植株出現(xiàn)特異條帶；大量提取PCR陽性玉米的DNA進行Southern雜交分析，9TQ5號植株在與bar探針和ABP9探針雜交時均出現(xiàn)特異條帶。[結(jié)論]9TQ5號植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株，為后續(xù)試驗提供了材料。

關(guān)鍵詞 分子鑒定；轉(zhuǎn)基因；ABP9；ZmCBF3

中圖分類號 S513 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03160-02

Abstract [Objective] In order to study the coordinated expression of plant stress induced gene ABP9 and ZmCBF3 effect on the resistance of maize， transgenic plants are desired. [Method] In this study， ABP9 and ZmCBF3 genes were introduced into maize through Agrobacterium tumefaciensmediated transformation， and transgenic plants at T0 generation were identified at molecular levels. We used the Agrobacterium stain containing an expression vector in which ABP9 and ZmCBF3 were driven by ABP9 promoter to infect the young ear of maize， and harvested T0 generation seeds. T0 plants tolerant to glufosinate were obtained by leafspray in the field. [Result] 10 glufosinate tolerant plants were selected and 5 of them were identified positive by PCR. Southern hybridization with bar and ABP9 probes showed that 9TQ5 had specific bands. [Conclusion] These results identified 9TQ5 as the transgenic plant， which will be used in further research.

Key words Molecular identification； Transgenic； ABP9； ZmCBF3

玉米是當(dāng)今中國最重要的糧食作物，其種植面積最廣，總產(chǎn)量最多，但在生產(chǎn)過程中，仍然面臨著許多嚴峻的問題[1]。玉米以其強的環(huán)境適應(yīng)能力而獲得了非常廣的種植，然而其中大部分地區(qū)屬于干旱或半干旱環(huán)境[2]。干旱抑制植物的正常生長，使植物光合效率下降，這對玉米的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)造成了嚴重的不良影響[3]，如2012年干旱和高溫造成淄博市玉米的大幅減產(chǎn)[4]。植物受到旱脅迫后，細胞膜上的“滲透感受器”能感知滲透壓的變化并激發(fā)細胞內(nèi)的第2信使系統(tǒng)[5]，進而誘導(dǎo)抗旱相關(guān)基因的表達，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括ABA依賴型和ABA非依賴型[6]。依賴ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的基因表達主要通過bZIP和MYB/MYC 2類轉(zhuǎn)錄因子與其相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合來介導(dǎo)[7]。目前已克隆得到的這類基因多達幾百個[8]，如擬南芥中的RD29B基因和RD22基因[7]，水稻中的OsMYB3R2基因[9]。

玉米過氧化氫酶基因Cat1是受ABA誘導(dǎo)的逆境響應(yīng)基因[10]。實驗室已經(jīng)通過酵母單雜交技術(shù)，使用玉米Cat1基因啟動子區(qū)的順式作用元件ABRE2篩選玉米幼胚cDNA文庫，分離得到玉米ABP9基因，并證明ABP9蛋白作為bZIP類轉(zhuǎn)錄因子參與了依賴ABA的逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[11]。ABP9基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達能夠顯著增強植株對于干旱、高鹽、低溫和氧化脅迫等多種逆境的抗性；同時，轉(zhuǎn)基因擬南芥在種子萌發(fā)、根系生長和氣孔開閉方面對外源ABA也表現(xiàn)出敏感性，能夠提高植株自身的節(jié)水能力[12-13]。在黑麥草中已證明ABP9基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性[14]；在大豆中的研究也取得了一定的進展[15]。這些都說明，ABP9基因在提高植物對非生物逆境的耐受性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

ZmCBF3轉(zhuǎn)錄因子是與擬南芥中受低溫逆境誘導(dǎo)表達的COR15a基因啟動子區(qū)C重復(fù)基序相結(jié)合的反式作用因子。前期研究表明，ZmCBF3參與玉米對逆境的響應(yīng)，受ABA和低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達，并且在胚發(fā)育過程中非常活躍[16]。ZmCBF3過表達的轉(zhuǎn)基因水稻，在正常生長狀況下并沒有表現(xiàn)出生產(chǎn)阻滯，與野生型水稻產(chǎn)量相當(dāng)；但是，在干旱、高鹽和低溫等逆境脅迫下，轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出高存活率、低丙二醛含量和相對低的電導(dǎo)率。這說明，ZmCBF3增加了水稻中逆境誘導(dǎo)基因的表達，增強了植株對于干旱、高鹽和低溫的耐受力[17]。筆者將ABP9基因和ZmCBF3基因構(gòu)建在同一雙元表達載體上并轉(zhuǎn)化玉米，并對轉(zhuǎn)基因T0代植株進行分子鑒定，以期為研究2個逆境誘導(dǎo)基因協(xié)同表達對抗逆性的影響以探索新的轉(zhuǎn)基因抗逆育種策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗所用玉米為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所選育的齊319自交系，種植于中國農(nóng)科院廊坊基地。農(nóng)桿菌C58C1菌株由實驗室保存，其中含有的pCAMBIA3301Pabp9ABP9Pabp9ZmCBF3質(zhì)粒由實驗室構(gòu)建（圖1）。試驗所用引物合成自生工公司，PCR擴增相關(guān)試劑購自寶生物公司，雜交用尼龍膜Amersham HybondN+購自GE公司，同位素購自同輻公司，探針合成試劑盒購自promega公司，內(nèi)切酶購自NEB公司，DNA回收試劑盒購自天根公司，Tris、SDS、CTAB購自sigma公司，草銨膦購自永農(nóng)公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化 以擬南芥花序浸染的方法為基礎(chǔ)，參照小麥和黑麥中對浸染方法的改良[18-19]，轉(zhuǎn)化玉米。由于玉米的雌穗被包葉包裹，所以試驗將農(nóng)桿菌液注射到包葉與雌穗之間，達到浸染的目的，從而轉(zhuǎn)化玉米。

1.3 田間篩選 pCAMBIA3301載體含有標(biāo)記基因bar，可提供草銨膦抗性，用于田間大規(guī)模篩選。實驗采用方法為：當(dāng)玉米生長至四葉期時，均勻噴灑濃度為0.03%的草銨膦溶液，保證每片葉子都均勻覆蓋。根據(jù)以往經(jīng)驗，1～2周即可觀察到明顯的結(jié)果。需要注意的問題是，噴灑草銨膦后6 h左右才能被葉片完全吸收，所以噴灑后6 h內(nèi)不能噴灌澆水或遭受降雨。

1.4 PCR擴增篩選 小量提取田間除草劑篩選后具有抗性的玉米植株的DNA[20]，作為PCR擴增模板，分別擴增標(biāo)記基因bar和目的基因之一的ABP9的特異片段，再通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。所用引物序列為：

bar：Fw：5TCAAATCTCGGTGACGGGC3，Rv：5ACGCACAATCCCACTATCCTTC3；

ABP9：Fw：5CGAAGAAAAAGAAGCTGGTGGAG3，Rv：5TGCGGGACTCTAATCATAAAAA CC3。

擴增片段長度分別為672和559 bp（圖1）。將20 μl反應(yīng)體系95 ℃變性5 min后，按94 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s進行35個循環(huán)的反應(yīng)，最后72 ℃再延伸10 min。

1.5 Southern雜交分析 大量提取PCR擴增陽性玉米植株的DNA[20]，取20 μg分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶Dra I和Hind III消化，經(jīng)過0.7%的瓊脂糖凝膠電泳分離，向上毛細管法轉(zhuǎn)移至帶正電的尼龍膜上。Dra I消化的DNA使用bar基因探針雜交；Hind III消化的DNA使用ABP9基因探針雜交。探針為“1.4”中所述引物PCR擴增質(zhì)粒所獲DNA片段（圖1），電泳回收后測序結(jié)果正確，使用α32PdCTP通過隨機引物法標(biāo)記。

2.3 Southern雜交結(jié)果 對篩選出的PCR陽性植株進行Southern雜交分析。經(jīng)過Dra I消化后的DNA使用bar基因的片段作為探針進行雜交（圖4a），5號樣品出現(xiàn)3條特異條帶，野生型無特異條帶。因此，這3條帶均為目的條帶。經(jīng)過Hind III消化后的DNA使用ABP9基因的片段作為探針進行雜交（圖4b），5號樣品出現(xiàn)5條雜交條帶，野生型齊319出現(xiàn)3條雜交條帶。因此，5號樣品有2條特異條帶，為轉(zhuǎn)入的目的基因。Southern雜交結(jié)果說明，9TQ5號植株為轉(zhuǎn)基因植株。

3 結(jié)論與討論

干旱在所有非生物逆境中，對作物的威脅最大。試驗將同為逆境誘導(dǎo)的ABP9和ZmCBF3基因共轉(zhuǎn)化玉米，并通過

玉米功能基因組研究需要創(chuàng)制大量的轉(zhuǎn)基因材料。但由于玉米自交系的遺傳轉(zhuǎn)化效率非常低且重復(fù)性差，并且基因組相對巨大且復(fù)雜，導(dǎo)致在轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定中，假陽性、假陰性的出現(xiàn)非常頻繁，因此需要綜合運用多種手段鑒定轉(zhuǎn)基因植株。試驗采用除草劑噴施、PCR擴增、Southern雜交等方法，對外源插入片段中的不同基因分別進行分子鑒定，并將結(jié)果綜合起來判斷，提高了篩選的準(zhǔn)確性。運用這些方法應(yīng)該注意的問題有：不同的玉米自交系對于除草劑的耐受性不同，需摸索確定所用轉(zhuǎn)基因受體自交系的除草劑敏感濃度；PCR鑒定中，重復(fù)性不好的植株應(yīng)該果斷排除；復(fù)雜基因組Southern雜交的優(yōu)化需要在具體試驗時不斷摸索。

參考文獻

[1] 趙久然，王榮煥.中國玉米生產(chǎn)發(fā)展歷程、存在問題及對策[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2013，15（3）：1-6.

[2] 佟屏亞.旱作玉米高產(chǎn)栽培技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，1994（7）：8-9.

[3] 王崇桃，李少昆.玉米生產(chǎn)限制因素評估與技術(shù)優(yōu)先序[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（6）：1136-1146.

[4] 邢茂德，張超.2012年淄博市麥套玉米減產(chǎn)原因分析與探討[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2013（4）：136-137.

[5] BOUDSOCQ M，LAURIE`RE C.Osmotic Signaling in Plants.Multiple Pathways Mediated by Emerging Kinase Families[J].Plant Physiology，2005，138：1185-1194.

[6] SHINOZAKI K，YAMAGUCHISHINOZAKI K.Gene networks involved in drought stress response and tolerance[J].Journal of Experimental Botany，2007，58（2）：221-227.

[7] FINKELSTEIN R R，GAMPALA S S L，ROCK C D.Abscisic Acid Signaling in Seeds and Seedlings[J].The Plant Cell，2002，14：15-45.

[8] SHINOZAKI K，YAMAGUCHISHINOZAKI K.Molecular responses to dehydration and low temperature：differences and crosstalk between two stress signaling pathways[J].Current Opinion in Plant Biology，2000，3（3）：217-223.

[9] DAI X Y，XU Y Y，MA Q B，et al.Overexpression of an R1R2R3 MYB Gene，OsMYB3R2，Increases Tolerance to Freezing，Drought，and Salt Stress in Transgenic Arabidopsis[J].Plant Physiology，2007，143（4）：1739-1751.

[10] GUAN L Q，SCANDALIOS J G.Effects of the plant growth regulator abscisic acid and high osmoticum on the developmental expression of the maize catalase genes[J].Physiologia Plantarum，1998，104：413-422.

[11] WANG L，ZHAO J，F(xiàn)AN Y L.Gene cloning and function analysis of ABP9 protein which specifically binds to ABRE2 motif of maize Cat1 gene[J].Chinese Science Bulletin，2002，47（22）：1871-1875.

[12] ZHANG X，WOLLENWEBER B，JIANG D，et al.Water deficits and heat shock effects on photosynthesis of a transgenic Arabidopsis thaliana constitutively expressing ABP9，a bZIP transcription factor[J].Journal of Experimental Botany，2008，59（4）：839-848.

[13] ZHANG X，WANG L，MENG H，et al.Maize ABP9 enhances tolerance to multiple stresses in transgenic Arabidopsis by modulating ABA signaling and cellular levels of reactive oxygen species[J].Plant Mol Biol，2011，75：365-378.

[14] 張磊，吳金霞，董芳，等.抗逆轉(zhuǎn)ABP9基因黑麥草和高羊茅植株的鑒定[J].草業(yè)科學(xué)，2010，27（7）：72-77.

[15] 王昌陵，趙軍，李英慧，等.轉(zhuǎn)錄因子ABP9轉(zhuǎn)化大豆及遺傳轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（7）：1908-1916.

[16] WANG L，LUO Y Z，ZHANG L，et al.Isolation and Characterization of a Crepeat Binding Transcription Factor from Maize[J].Journal of Integrative Plant Biology，2008，50（8）：965-974.

[17] XU M Y，LI L H，F(xiàn)AN Y L，et al.ZmCBF3 overexpression improves tolerance to abiotic stress in transgenic rice（Oryza sativa）without yield penalty[J].Plant Cell Rep，2011，30：1949-1957.

[18] ZALE J M，AGARWAL S，LOAR S，et al.Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Cell Rep，2009，28：903-913.

[19] DELAPEA A，LRZ H，SCHELL J.Transgenic rye plants obtained by injecting DNA into young floral tillers[J].Nature，1987，325：274-276.

[20] 薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南 [M].3版.北京：科學(xué)出版社，2002.