IgY抗體在免疫檢測中的應用進展

摘要 卵黃免疫球蛋白（Immunoglobulin of yolk，IgY） 是鳥類、爬行動物和兩棲類動物體內的主要抗體，與哺乳動物IgG功能類似，一般從被抗原免疫的母雞卵黃中提取。與IgG相比，IgY具有許多突出的優點，在制備針對多種抗原的多克隆抗體、免疫檢測、人類和動物疾病的預防治療等方面均得到廣泛應用。對IgY在免疫檢測方面的應用進展進行了綜述。

關鍵詞 IgY；免疫檢測；應用

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10147-03

作者簡介張靜靜（1980- ），女，山東濰坊人，中級工程師，碩士，從事生物技術方面的研究。

傳統上，使用哺乳動物來源的IgG抗體作為檢測抗體，應用免疫擴散、ELISA、免疫印跡法等技術手段，可以定性或定量檢測相應的抗原或抗體。卵黃免疫球蛋白（Immunoglobulin of yolk），又稱為IgY或卵黃抗體，是鳥類、爬行動物和兩棲類動物體內的主要抗體，一般從被抗原免疫的母雞卵黃中提取。與IgG相比，IgY具有抗原用量少、制備周期短、對動物損傷小、產量大、特異性強、靈敏度高等優點，近年來逐漸引起人們的關注，應用越來越廣泛。筆者綜述了IgY在免疫檢測方面的應用研究進展。

1IgY的分子結構

與IgG大分子結構類似，IgY大分子也包括2條重鏈和2條輕鏈，鏈的形態類似于希臘字母“Y”， Fc區存在2個抗原結合位點。然而，IgG和IgY之間存在明顯的差異。IgG分子量為160 kD，IgY分子量為180 kD；IgY沒有真正的鉸鏈區，有人認為IgY重鏈的Cυ2區后來進化成了哺乳動物IgG的鉸鏈區。另外，IgY能夠介導過敏反應，與哺乳動物IgE抗體功能一致，功能結構也存在相似性，有人認為IgY是IgG 和 IgE的起源分子[1]。IgY重鏈分子量為67～70 kD，有1個可變區（V）和4個穩定區（C）。輕鏈分子量為25 kD，包含1個可變區和1個穩定區。與IgG相比，IgY輕鏈分子量要小，限制了Cυ2區的流動性。IgY的疏水基團多于IgG。比較IgG和IgY的C端序列，IgG的 Cγ2和 Cγ3區與 IgY的 Cυ3和 Cυ4區十分相似[2]。

2IgY抗體應用于免疫檢測的優勢

2.1易獲得，產量高傳統方法通過采血和宰殺動物收集抗體，IgY從卵黃中提取，對實驗動物和操作者都無損傷，簡單易行，經濟溫和。同時，與IgG相比，IgY產量高。按1只母雞每月產20只雞蛋計算，每只母雞1個月能生產至少2 g IgY，相當于1只大型哺乳動物血清中抗體的含量[1]。近年來，隨著雞源性抗體片段分離報道的增加，引起了科學家們建立雞抗體庫的興趣[3]。例如，Nishibori等[4]獲得了人源性雞單克隆抗-IL12抗體。重組技術的的應用可以在無需免疫的情況下從雞抗體庫里篩選到IgY或IgY類抗體。

2.2假陽性或假陰性率低，特異性強研究表明，IgY不與血清中的類風濕因子（RF）、人抗鼠抗體（HAMA）、抗-IgG抗體和抗體結合物發生交叉反應，不激活補體系統等，也不與葡萄球菌蛋白A和鏈狀球菌蛋白G發生反應，可以明顯減少假陽性或假陰性的產生，增強檢測特異性[5]。

2.3靈敏度高由于禽類和哺乳動物之間存在明顯的種系和基因學背景差異，IgY能識別更多的哺乳動物抗原表位，從而增強免疫信號。研究表明，IgY的抗體親和力為鼠抗IgG的3～5倍[3]。

2.4性質穩定與IgG相比，IgY具有耐熱、耐酸和一定的抗酶降解的能力。在PH4-9以及小于65 ℃的溶液中，IgY能夠保持穩定。研究還發現，IgY具有耐高滲性能 （在60%的高濃度蔗糖溶液中仍有活性）和很好的耐反復凍融的特性[5]。

3 IgY抗體在免疫檢測中的應用

3.1寄生蟲感染的檢測旋毛蟲幼蟲進入宿主體內后，排泄-分泌物（Excretorysecretory，ES）會形成循環抗原（Circulating antigens，CAg），CAg在血液出現的時間早于抗體，其半衰期短于抗體，因此檢測 CAg可區分既往感染和現癥感染，尤其適用于早期診斷和療效考核。但是，由于CAg在血清中的含量通常較低，常規的夾心法ELISA檢測旋毛蟲感染小鼠與豬CAg檢出率僅為19%～54%，旋毛蟲病患者血清中的CAg檢出率僅為29.9%。Liu等[6]制備了抗-ES-IgY，以抗-ES-IgY作為捕獲抗體建立夾心法ELISA，檢測敏感度達到1 ng/ml。

Lei等[7]制備了抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原（Soluble egg antigen，SEA）的IgY（抗-SEA IgY），并將抗-SEA IgY耦聯在納米磁珠上，建立了基于IgY的免疫磁珠夾心ELISA法（IgYIMB-ELISA），應用IgYIMBELISA法檢測血吸蟲感染小鼠血清和尿液中及血吸蟲病患者血清中的循環可溶性蟲卵抗原。這為檢測日本血吸蟲感染提供了新的技術。

3.2細菌感染及污染的免疫檢測副溶血性弧菌是海水養殖中主要的病原菌之一，不僅能引起魚蝦等多種水產動物的疾病，而且能通過污染水產品而導致人食物中毒。常規檢測方法周期長、操作復雜，已經不能滿足當今食品安全檢測的需要。何斌彬等[8]制備了抗副溶血性弧菌的特異性IgY，建立間接ELISA法檢測副溶血性弧菌。結果表明，該方法穩定性、重復性良好，對純培養菌液的檢出限為1.0×105cfu/ml，具有良好的敏感性。

金黃色葡萄球菌感染食品后產生的金黃色葡萄球菌腸毒素（SEs），是引起金黃色葡萄球菌食物中毒的主要原因。Jin 等[9]制備了抗- SEs -IgY，代替IgG應用在檢測SEs的雙抗體夾心ELISA、膠體金方法中。結果表明，新的檢測方法樣品不需要稀釋，不受葡萄球菌A蛋白的干擾，省時，敏感度高，膠體金方法能夠在15 min內檢測出牛奶中0.2 ng/ml的SEs。Reddy等[10]建立了應用IgY的檢測金黃色葡萄球菌毒素A（SEA）的免疫捕獲PCR-ELISA的方法，檢測敏感度可達約10 pg/ml。

3.3病毒感染的免疫檢測為了判斷感染呼吸綜合癥冠狀病毒（SARSCoV）疑似個體的存在及感染程度，Palaniyappan等[11]制備了抗-SARSCoV NP（呼吸綜合癥冠狀病毒衣殼蛋白）IgY，建立了檢測SARSCoV NP的夾心法ELISA，靈敏度達到18.5 pg/ml，并且能夠定量檢測SARSCoV。禽類呼腸弧病毒（ARV）在家禽飼養中是引起家禽養殖損失的重要致病因素，病毒外層衣殼蛋白（σC），特異性結合禽類細胞，在ARV感染和致病時起重要作用。Jung等[12]克隆了σC基因，在E.coli中進行表達，并制備了重組ARVσC的IgY抗體，此IgY抗體能夠中和感染ARV的乳倉鼠腎細胞中的ARV，也可以應用在ELISA和斑點雜交法中特異檢測ARV，不受其他病毒的干擾。

目前，重組IgY抗體也被應用在病毒的檢測中。Kazuyoshi等[13]制備了2個重組IgY抗體：Ab315 和 Ab419可結合哺乳動物朊蛋白（PrP）。試驗表明，其在識別牛海綿狀腦病朊蛋白和羊瘙癢病致病朊蛋白時具有較高的敏感性，顯示了其在診斷朊蛋白病方面的良好前景。

3.4臨床標志物的免疫檢測

3.4.1腫瘤標志物的免疫檢測。目前，腫瘤標志物的檢測在腫瘤診斷、療效判定、隨訪觀察等方面發揮了越來越重要的作用。其中，抗腫瘤標志物IgY抗體的應用使腫瘤標志物的檢測技術在檢測靈敏度、特異性、定量等方面的優勢得到進一步提升。

CA153是一種乳腺癌細胞和某些上皮細胞分化抗原，在乳腺癌診斷和判斷預后中位于首位。Grzywa 等[14]制備抗-CA153 IgY，建立雙抗體夾心法ELISA檢測CA153，敏感度達0.028 U/ml。HER2為I型生長因子受體中的一種穿膜糖蛋白，在細胞膜上以單體形式存在，被激活后能促進腫瘤細胞增殖和分化，在人乳腺癌中的激活也比較常見。Xiao等[15]構建了抗- HER2 IgY與單壁碳納米管（SWNTs）的結合物，研究表明此結合物能夠特異性的導向表達HER2的SK-BR-3細胞，不結合不表達HER2的MCF-7細胞，顯示了其在腫瘤檢測和治療方面的良好前景。免疫組化（IHC）是活體組織腫瘤標志物檢測的傳統的重要技術手段，但由于IgG抗體的非特異性吸附及傳統熒光染料的不穩定性，IHC無法實現定量檢測活體組織腫瘤標志物。Xiao等[16]用IgY代替IgG，結合量子點熒光技術，使IHC定量檢測腫瘤標志物具有羅好的前景。

3.4.2其他臨床標志物的檢測。王春宇等[17]采用表面等離子體共振（SPR）方法，用IgY取代IgG作為識別分子偶聯于CM5傳感芯片上，對人血清中的轉鐵蛋白進行了檢測。結果表明，與傳統方法相比該方法簡單可行，具有良好的重現性和準確性。蔣洪嬌等[18]成功制備了抗Cystatin C IgY，建立雙抗體夾心ELISA檢測體系，證明其在檢測Cystatin C具有較好的靈敏度和特異性。

艾杜糖-2-硫酸酯酶（IDS）是人體中的一種酶，IDS的缺失引起黏多糖貯積癥Ⅱ型（MPS II）。Sosa AC等[19 ]在巴斯德畢赤酵母中建立了重組IDS（hrIDS）的表達系統，制備了特異抗-IDS氨基酸序列的IgY抗體，應用夾心法ELISA定量檢測人體液中的IDS以及畢赤酵母表達系統生產的hrIDS。試驗證明，這是一種特異性強、靈敏度高的方法。

3.5其他方面免疫檢測的應用 Sunwoo等[ 20]制備了抗-乳鐵蛋白IgY，建立了定量檢測乳鐵蛋白的夾心ELISA，此方法既可以應用于骨質疏松、貧血等疾病的診斷，又可以定量檢測乳制品中乳鐵蛋白，應用于食品檢測方面。桔霉素是由真菌產生的次級代謝產物，是一種真菌毒素，具有一定的毒性。Duan等[21]制備了抗-橘霉素IgY，建立了檢測橘霉素的間接法ELISA，結果表明其檢測靈敏度達到10 ng/ml，并且能夠在20～640 ng/ml檢測范圍內建立良好的線性標準對橘霉素進行定量檢測，結果表明IgY應用于橘霉素檢測避免人們攝入橘霉素受到傷害具有良好前景。

4小結

通過免疫母雞從卵黃中提取特異性的IgY，或者制備特異性的重組IgY，結合一定的檢測手段，如間接法ELISA、免疫磁珠夾心ELISA法、膠體金法、應用量子點熒光技術的免疫組化法、構建IgY與單壁碳納米管（SWNTs）的結合物、表面等離子體共振（SPR）方法，IgY可以應用于寄生蟲感染、細菌感染及污染、病毒感染、包括腫瘤標志物在內的臨床標志物、食品等的免疫檢測中，與IgG的傳統檢測方法相比，其靈敏度高，特異性強，可進行定量檢測，并且易獲得，產量高，性質穩定，充分顯示了其在免疫檢測方面應用的良好前景。在實際應用中，若要實現在免疫檢測領域的產業化應用，還需要進一步研究。

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