紅芽大戟組織培養研究進展

摘要[目的]論述紅芽大戟組織培養的研究現狀。[方法]從外植體的選擇及消毒、培養基及激素選擇、組培苗生根及移栽等方面進行論述，并探討了紅芽大戟組織培養研究中存在的問題以及未來的研究和發展方向。[結果]芽或莖尖是紅芽大戟組織培養合適的外植體；不同植物種類或不同品種對激素的要求不同，目前所采用的培養基主要為MS、B5、Miller培養基，不同誘導階段所采用的培養基的種類和濃度也不盡相同；組培苗移栽主要注意基質、移栽溫度和濕度、移栽季節及水肥等方面。組織培養快繁技術研究仍處在初步研究階段，技術尚未成熟，今后應該加強研究的關鍵問題主要有解決外植體污染難題，提高外植體誘導成功率；提高芽苗生根率及組培苗移栽成活率等。[結論]該研究為人工栽培紅芽大戟提供有價值的參考。

關鍵詞 紅芽大戟；組織培養；外植體；培養基；生根

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10136-03

基金項目廣西自然科學基金（2010GXNSFB013022）；廣西科學院基金（12YJ25SWS22）。

作者簡介張紅巖（1980-），女，山東濰坊人，助理研究員，碩士，從事熱帶經濟作物組培及轉基因研究工作。*通訊作者，副研究員，從事熱帶經濟作物組培及轉基因研究工作。

紅芽大戟（Knoxia valerianoides Thorel et Pitard）別名紅大戟、紫大戟、廣大戟、將軍草等，為茜草科多年生草本植物，主產廣西、廣東，生于低山坡草叢中的半陰半陽處[1-2]。紅芽大戟以塊根入藥，主要化學成分為蒽醌類化合物，主治胸腹積水、痰飲喘滿、水腫腹脹、二便不利、癰腫瘡毒等，具有瀉水、解毒、散結的功效。還具有抗菌作用，特別是對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌有較強的抑制作用，可以治療狂癥，是中成藥紫金錠的主藥[3-4]。

紅芽大戟作為一種珍貴的中藥材，繁殖非常緩慢，在自然界中主要通過種子繁殖。但由于種胚發育不良，自然散落的種子發芽率不到l%。采用常規方法貯藏1年以上的種子，基本喪失活力，幾乎不能出苗[5-6]。近年來，隨著紅芽大戟市場需求量的增加，其價位不斷上升而引發了濫采亂挖，致使野生資源已瀕臨枯竭[7]。20世紀80年代后雖然已開展人工栽培試驗研究，但均因種苗問題而難以推廣。紅芽大戟組織培養和快速繁殖不僅對保護野生藥用植物資源有著積極的意義，且能縮短其生長周期，實現快速繁殖，滿足市場對紅芽大戟藥材的需求；同時，廣闊的市場需求空間和開發利用也必定帶動了種植業、藥材加工業和相關產業的發展[8]。筆者從外植體選擇及處理、植物生長調節劑使用、組織培養條件和組培苗的移栽等方面，對近年來紅芽大戟組織培養的研究概況進行綜述，以期為以后的研究提供有價值的參考。

1外植體材料的選擇和處理

1.1外植體的選擇外植體是指從植物組織或器官上切割下來并用于組織培養的原始體小塊[9]。目前組織培養已經獲得成功的植物，外植體幾乎包括了植物體的各個部位。但不同種類的植物以及同種植物不同的器官，對誘導條件的反應不同，有的部位誘導成功率高，而有的部位很難脫分化；有時，即使脫分化，再分化頻率也很低，或僅分化出芽而不長根，或僅長根而不長芽。因此，外植體類型是影響植物組織培養效果的首要因素[10]。目前有關紅芽大戟組織培養報道中，采用的外植體材料大多為新生枝莖尖，也有用葉片、莖段等材料的報道。韋瑩等將紅芽大戟葉片、嫩芽、莖段作為誘導愈傷組織的外植體，均能誘導出愈傷組織，葉片的愈傷組織體積很小，緊密；嫩芽和莖段的愈傷組織質量較好、疏松、體積較大，但除嫩芽外，葉片和莖段的愈傷組織在分化培養中均無法分化出綠點和叢生芽；試驗結果表明，嫩芽是最適宜紅芽大戟愈傷組織誘導分化的最佳外植體[11]。這與陳芳清等的研究結果[12]相似，在莖、葉和芽3種外植體中，芽的出愈率最高，愈傷組織褐化率低，生長最好，且易被誘導出不定芽，是較理想的快速繁殖材料；而莖和葉的愈傷組織褐化率高，難以誘導出不定芽。凌征柱等以莖尖為外植體經愈傷后得到叢生芽[8]。以上結果表明，芽或莖尖是紅芽大戟組織培養合適的外植體。

1.2外植體的處理外植體材料的滅菌消毒是植物組織培養的第一步，也是外植體初代培養中關鍵的技術環節。這一環節決定了組織培養工作能否進行下去[13]。組織培養中常用的滅菌劑的種類很多，常用的有次氯酸鈉溶液（含有效氯0.4%～0.5%）、過氧化氫10%～12%水溶液、升汞0.1%水溶液，其中前2種滅菌劑對接種材料比較安全，但滅菌時間較長，常使接種材料外層氧化變褐，且滅菌效果不如升汞。升汞有很強的殺菌能力，但浸泡時間稍長，會造成接種材料中毒，滅菌10 min后，大部分分生組織褐化嚴重，因此，材料消毒處理時間不能過長。凌征柱等將紅大戟嫩莖置于洗衣粉水中浸泡10 min，用自來水流水沖洗20 min；在超凈工作臺上用0.1%HgCl2浸泡消毒8 min，然后用無菌水浸洗4次，每次2 min[8]。黃浩用自來水將表面塵土沖洗干凈，用75%的酒精進行表面擦拭消毒，然后在無菌操作臺中剪成長度約為2 cm的植株段和單獨的葉片，置于已滅菌的寬口瓶用0.1%HgCl2浸泡10 min，并不斷地搖動，然后用無菌水沖洗4～5遍，再用已滅菌過的濾紙吸干表面水分置于超凈臺上備用[14]。

2 培養基及激素的選擇

培養基的種類、激素成分和組合對外植體的分化至關重要。對植物組織培養而言，一旦外植體確定，影響其再生效果的最為關鍵因素即為培養基（激素的種類及濃度）和培養條件，不同植物種類或不同品種對激素的要求不同。目前有關紅芽大戟組織培養報道，所采用的培養基主要為MS、B5、Miller培養基，不同誘導階段所采用的培養基的種類和濃度也不盡相同。

2.1誘導分化培養基在植物組織培養中，主要目標誘導愈傷組織形成和形態發生，使一個離體的細胞、一塊組織或一個器官的細胞通過脫分化形成愈傷組織，并由愈傷組織再分化形成植物體。有關紅芽大戟誘導愈傷的報道多采用MS培養基，所用的激素主要為6-BA及NAA。凌征柱等將消毒好的外植體接到誘導培養基（MS+BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L）上，約15 d后，莖尖的切口處開始膨大產生乳白色的愈傷組織；愈傷組織隨著培養時間的延長而逐漸增大并變淺黃色；大約25 d后在切口處長有愈傷組織的地方長出叢生芽2～3個；35 d后，便可形成6～8個芽的叢芽；60 d后，就能長出帶有3～4節8 cm高的小苗[8]。韋瑩等研究不同激素種類及濃度對紅芽大戟愈傷組織的影響發現，紅芽大戟的嫩芽和莖段在含有不同濃度2，4-D培養基中誘導的愈傷組織誘導率很高，均達95%以上，且無褐化，但愈傷組織質量隨濃度的增大呈先增加后降低的趨勢，濃度為1.0～1.5 mg/L效果最好，但愈傷組織均呈透明淡黃色，質地疏松，分化培養基中無法分化叢生芽，因此，2， 4-D不利于紅芽大戟愈傷組織的誘導； 經過進一步對6-BA及NAA的濃度及比例進行優化，得到紅芽大戟愈傷最優激素組合為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L[11]。

2.2繼代增殖增殖培養是一個既要保障試管苗健壯生長，又要保證隱芽、腋芽以及不定芽的分化和生長的過程[15]。芽的增殖和生長受到培養基中的細胞分裂素和生長素（NAA）含量的控制。凌征柱等研究的誘導培養基誘導出的叢芽，切成帶有愈傷組織的2個芽為一叢，接種于繼代增殖培養基（MS+BA 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L）上；15 d后，在基部的節上長出叢芽5～6個，25 d后，新長的叢芽就可達到6～8 cm高[8]。黃浩研究不同激素種類及濃度對紅芽大戟繼代增殖培養基發現，在繼代培養中，應同時添加6-BA、NAA和MET，較好的濃度配比為6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+MET 0.8 mg/L，芽增殖倍數最高可達4.20倍[14]。張弘等采用平鋪的方式，將誘導出的叢生芽接種于MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養基中，芽增殖數最高為6.98[16]。

2.3生根不定根的形成是組織培養過程中非常關鍵環節，它直接影響到組培苗移栽成活率的高低[17]。組培苗的生根效果與培養基的組成、添加激素的種類及濃度有關。黃浩等以紅芽大戟繼代苗為試驗材料，1/2 MS為基本培養基，研究了不同濃度的生長素、多效唑（MET）、生根粉（ABT）對紅芽大戟組培苗生根誘導的影響，結果表明，NAA不利于紅芽大戟的生根誘導，IBA和IAA單一使用的最佳濃度均為0.5 mg/L，IAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L的配組處理對根的誘導效果相對較好；MET在濃度為1.4 mg/L時對紅芽大戟生根誘導效果最好；最佳的生根誘導激素配組為MET l.4 mg/L+IBA 0.2 mg/L，生根率、平均生根條數和平均根粗達最大，分別為89%、6.27條和0.78 mm[7]。凌征柱等將長至6 cm以上高的健壯芽苗單個切下，轉入生根培養基（1/2MS+NAA 1.0 mg/L）上培養，15 d后，芽苗的基部與培養基相接觸的莖段膨大，28 d后，莖段膨大的地方長出10條左右的須根，靠近基部的1～3節上亦有少量（2～3條/節）須根長出，生根率100%[8]。張弘等研究紅芽大戟的最佳誘導生根培養基為1/2MS+1.0 mg/L NAA或1/2MS+0.1 mg/L ABT，生根率均可達100%[16]。

3 組培苗的移栽

組培苗移栽是關系到能否實現工廠化育苗的關鍵，目前對紅芽大戟組培苗移栽報道的主要是從基質、移栽溫度和濕度、移栽季節及水肥等方面的研究。移栽基質的選擇原則是疏松透氣，具有一定的保水保肥能力[18]。移栽的試管苗植株和活體生根的小植株，濕度控制十分重要。因為試管苗在培養瓶培養時為高濕（相對濕度為90%～100%）環境，莖葉表面沒有防止水分散失的角質層，根系不發達，即使移栽后根系周圍有足夠的水分也難以保證水分平衡。在紅芽大戟生根苗移栽到基質后，要覆蓋塑料薄膜、經常噴水霧，控制相對濕度不低于85%，提高空氣濕度，減少葉面蒸騰；同時，控制溫度在30 ℃以下，避免溫度過高導致蒸騰作用加強，水分失衡和微生物滋生等；在10～20 d，可半揭開塑料薄膜，逐漸降低相對濕度，使其漸漸適應自然環境；20 d后，可完全去掉塑料薄膜，但要注意保證土壤的濕度。另外，在移栽的過程中，還需加蓋遮蔭網，以控制光照強度，避免陽光直射。黃浩等以紅芽大戟組培生根苗為移栽材料，研究了不同基質、水肥處理和季節對紅芽大戟組培苗移栽效果的影響，結果表明，較佳的移栽季節為2～4月，噴施0.07%的KH2PO4溶液有利紅芽大戟組培苗的移栽生長，以泥炭+珍珠巖（1∶1）作為移栽基質效果最好，在移栽后10 d，加強對移栽苗的管理，相對濕度不低于85%，溫度控制在15～30 ℃，成活率可達85%以上[19]。凌征柱等將發育良好、具有3個節以上的試管苗瓶蓋打開，置室內常溫下煉苗3～4 d，取出小苗，用清水洗去根部培養基，因為紅大戟試管苗沒長有主根，全部為須根，直接移栽營養杯紅大戟試管苗較難成活，為提高紅大戟試管苗的移栽成活率，應先移植到陰蔽度為70%的育苗棚內的沙床中（細河砂），待須根長得粗壯一些再移植到營養杯進行培植[8]。

4存在問題及展望

紅芽大戟組織培養研究的成功，解決我國對紅芽大戟資源保護、因自然繁殖困難導致藥材緊缺等難題，不僅對保護野生藥用植物資源有著積極的意義，且能縮短其生長周期，實現快速繁殖，滿足市場對紅芽大戟藥材的需求；成功解決了多年人工栽培渴望解決的種苗問題，對推動人工栽培紅大戟起著很重要的作用，對保護瀕臨滅絕的紅大戟野生資源及可持續利用有著積極的意義。但紅芽大戟的組織培養快繁技術研究仍處在初步研究階段，技術尚未成熟，還沒有形成一個比較完善的技術體系，還不能實現紅芽大戟的工廠化育苗，尚有許多問題需進一步研究與完善。今后應該加強研究的關鍵問題主要有解決外植體污染難題，提高外植體誘導成功率；提高芽苗生根率及組培苗移栽成活率等。

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