藥物緩釋靈芝多糖載體：工藝優化和自由基清除能力評價

摘要：目的 優化靈芝多糖的制備工藝并評價其清除自由基能力。方法 使用熱水浸提法從靈芝中提取醛基化天然多糖，根據Fenton反應原理對靈芝多糖清除自由基的能力進行分析。結果 料液比為1︰25，在70℃下浸提2.5h，提得率達到最高值2.6%。靈芝多糖對·OH的 IC50 最高可達1.58 mg·ml-1，對·O-2的IC50達2.83 mg·mL-1。結論 優化的最佳制備工藝為：料液比為1∶25，熱水浸提的時間為2.5h，提取的溫度在70℃左右。所制備的靈芝多糖具有良好的清除自由基能力。

關鍵詞：靈芝多糖；自由基；熱水浸提法

靈芝多糖具有提高機體免疫力、抑制腫瘤、延緩衰老等多種藥理活性[1]。近年來，國內學者發現天然植物多糖修飾的聚陽離子作為基因藥物載體具有無毒、無免疫原性、可降解性等特點[2-3]。靈芝多糖的發現與藥理研究，為靈芝用作癌癥化學治療與放射治療的輔助劑提供了重要的理論依據。

自由基不僅是生體多種生理功能的啟動因素和生化反應的介導者，同時也在免疫細胞因子網絡中起調節、信號轉導作用[4]。現代醫學認為，人類機體內自由基隨著年齡的增長其自穩態平衡性下降，從而導致自身免疫功能下降，容易引發腫瘤、動脈粥樣硬化、原發性高血壓等自由基疾病[5]。有研究表明真菌提取物對自由基有一定的清除作用[6]。而多糖是真菌中的主要活性成分，因此多糖對自由基可能也具有一定的清除作用，但這些需要進一步的實驗研究。

1 實驗方法

1.1靈芝多糖的制備 本研究采用熱水浸提法提取靈芝多糖，具體方法是：將破壁靈芝孢子粉與去離子水配制成不同料液比的懸液，在不同溫度下浸提一段時間；以Sevage試劑[氯仿：正丁醇=5∶1（V/V）]除蛋白6、7次，直至蛋白質除盡。用旋轉蒸發儀在60℃蒸餾濃縮，并用離心機取沉淀物（靈芝粉）。將靈芝粉配成重量比為5%的靈芝粉水溶液，在65℃～75℃攪拌下反應4h。靜止沉降后取上層清液，再重復提取1～2次。將該濃縮液體放入95%乙醇中純化、干燥。將提取的靈芝多糖配成質量分數為2%的水溶液加入高碘酸鈉，避光磁力攪拌下反應24h，隨后加入乙二醇終止反應15min，終止液加入NaCl，混勻5min，按體積比1：5倒入無水乙醇中沉淀、析出，將沉淀物干燥后得終產物醛基化靈芝多糖。

1.2性能測試

1.2.1對羥自由基（oOH）的清除作用 根據Fen-ton反應原理， H2O2在Fe2+存在時生成·OH，反應式如下：Fe2++ H2O2→Fe3++·OH +OH-。·OH可使番紅花T褪色。反應體系終體積4.5mL，其中含150mmol·L-1硫酸鈉鹽緩沖溶液（pH值7.4）、114 μmol·L-1番紅花T、1.927 mmol·L-1 EDTA·Na2、1.0 mmol·L-1 硫酸亞鐵、3% H2O2 以及不同濃度的樣品，在37℃恒溫水浴30min后，加入0.3mmol·L-1 EDTA·Na2終止反應，以緩沖溶液作參比檢測其OD值。空白組以0.1mL蒸餾水替代樣品，對照組以1.5mL蒸餾水替代樣品和 EDTA·Na2。清除率=（A樣品-A空白）/A對照×100%。

1.2.3對超氧陰離子自由基（·O-2）的清除作用 鄰苯三酚在堿性條件下能發生自氧化生成有色中間物和·O-2，依據有色中間物的生成量可判斷·O-2的生成量。將0.1mL不同濃度的樣品，在25℃水浴20min后加入3mL濃度為7 mmol·L-1的鄰苯三酚，反應4min后加入10mmol·L-1的HCl終止反應，以Tris-HCl緩沖溶液作參比，在420nm處測OD值。對照組以0.1mL蒸餾水替代樣品，空白組為不加鄰苯三酚。按下式計算清除率：清除率=（A'樣品-A'空白）∕A'對照×100%。

2 結果與討論

2.1熱水浸提法提取工藝的優化 首先確定熱水浸提法的最適溫度。稱取2g靈芝孢子粉，分別于溫度在80℃，70℃和60℃浸提，料液比控制在1∶25，測試不同溫度下不同時間的浸出率，其結果如圖1所示。可以看出不同溫度下，提出的速率不同，但溫度過高會導致多糖的水解。因此，在80℃下隨著時間的推移吸光度和浸提率也沒有明顯的變化趨勢。而當溫度為60℃、70℃時，隨著時間的變化吸光度和浸提率都明顯上升趨勢，比較兩個溫度，70℃下吸光度變化更明顯，因此70℃為更適宜溫度。從圖中還可看出，反應時間超過2.5h時浸出率出現了下降或者維持不變，表明最佳浸提時間當為2.5h左右。

料液比是熱水浸提法提取靈芝多糖的另一個重要參數。選配料液比分別為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30的靈芝孢子懸液，在70℃下浸提，每30min測定多糖吸光度A490并計算浸出率。結果如圖2所示，料液比在1∶25的樣品浸提2.5h后，多糖浸出率最高，達到2.63 %，故最佳料液比應選為1∶25。

1.2.2多糖清除自由基能力的評價 由表1可知，隨著靈芝多糖濃度的增加，對Fen-ton反應體系產生的羥自由基·OH和鄰苯三酚自氧化體系產生的超氧陰離子自由基·O-2的清除率相應增大。在相同濃度下，提取的靈芝多糖對·OH的清除效果明顯強于·O-2。對兩種自由基的清除值IC50分別高達1.58mg·mL-1和2.83mg·mL-1。樣品濃度和清除率基本呈現正相關關系，說明量效關系非常明顯。此外，靈芝多糖清除羥自由基·OH的能力強于超氧陰離子自由基·O-2。

3 結論

3.1控制料液比在1∶25，溫度70℃，保溫2.5h，有利于多糖浸提。

3.2對不同自由基的清除能力進行比較，結果表明提取的靈芝多糖清除羥自由基·OH的能力和超氧陰離子自由基·O-2均較好，并且清除能力和多糖濃度存在明顯的正相關量效關系，相對而言，靈芝多糖清除羥自由基·OH的能力優于清除超氧陰離子自由基·O-2的能力。

參考文獻：

[1]Y. H. You， Z. B. Lin. Protective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide on injury of macrophages induced by reactive oxygen species [J]. Acta Pharmacol Sinica， 2009， 23（9）： 787-791.

[2]W. R. Gombotz， S. F. Wee. Protein release from alginate [J]. Adv Drug Deliver Rev，2009，31（3）：267-285.

[3]V. Lenaerts， Y. Dumoulin， M. A. Mateescu. Controlled release of theophyline from crosslinked anylose tables [J]. J Control Release，2008，15（1）：39-46.

[4]李榮芷，何云慶.靈芝抗衰老機理與活性成分靈芝多糖的化學與構效研究[J].北京醫科大學學報，2004，23（6）：473-475.

[5]游育紅，林志彬.靈芝多糖肽的抗氧化作用[J].藥學學報，2003，38（2）：85-88.

[6]肖建輝，蔣儂輝，梁宗琪，等.食藥用真菌多糖研究進展[J].生命的化學，2005，22（2）：148-151.

編輯/哈濤