婦科手術快速冷凍切片最佳冷凍時間的探尋及制片體會

[摘要] 目的 探討婦科不同組織快速冷凍切片的最佳冷凍時間。 方法 選取我院2014年1月1日～8月31日婦科手術快速冰凍標本350例，觀察不同冷凍時間對組織制片效果及診斷結果的影響，并與石蠟切片做對照。 結果 350例快速冷凍組織“冷凍2 min左右”時能做出正確診斷的例數為332例，診斷百分率為94.9%，“加2 min后”能做出正確診斷的例數為329例，診斷百分率為94.0%。“加5 min后”能做出正確診斷的例數為236例，診斷百分率為67.4%。 結論 “冷凍2 min左右”和“加2 min后”是婦科快速冷凍組織切片的最佳時間。不同的組織種類由于各成分構成比例不同，故實際工作中要根據組織的這種特性選擇冷凍時間以達到最佳制片效果。

[關鍵詞] 快速冷凍；最佳時間；病理切片；婦科手術

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）36-0048-04

Exploration and experience of optimal quick frozen-section time for gynecological specimens

MA Banglei MI Fangyuan LI Fengshan GU Yun

Department of Pathology， Nanjing Maternity and Child Health Care Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210004，China

[Abstract] Objective To explore the best frozen time of different frozen sections of gynecological tissues. Methods A total of 350 quick frozen specimens of gynecologic operations were selected from Nanjing Maternity and Child Health Care Hospital Affiliated to Nanjing Medical University between Jan 1 2014 and Aug 31 2014. The influences of different frozen time on the quick frozen sections and pathologic diagnosis were observed，and compared with paraffin sections'. Results 350 cases fast frozen tissue \"freeze about 2 min\" could make a correct diagnosis 332 cases， the diagnosis of percentage was 94.9%， “after plus 2 min”could make a correct diagnosis 329 cases， the diagnosis of percentage was 94%；“after plus 2 min” could make a correct diagnosis 236 cases，the diagnosis of percentage was 67.4%. Conclusion “freeze about 2 min” and “after plus 2 min” is the best time for gynecologic rapid frozen section. Different tissue types due to the different proportion of components， so the actual work according to this characteristic of organizational choice frozen time in order to achieve the best production effect.

[Key words] Quick freezing； The best time； Pathological； Gynecological operation

快速冰凍診斷是病理科非常重要的一項工作，病理醫生需要在手術進行的過程中，用最短的時間對送檢標本進行良、惡性的鑒別，為手術醫生決定下一步的手術方案和手術范圍提供可靠依據[1]， 上述醫療環境，決定了冰凍切片檢查報告必須準確、快速。冰凍切片是利用低溫使組織迅速冷凍達到一定的硬度，利用恒溫切片機進行切片的一種方法[2]，冰凍切片質量的優劣，制片速度的快慢，無疑會影響病理診斷，增加術中快速診斷的風險[3]，并與患者的安危息息相關。我科在制作冰凍切片的過程中，通過不斷的摸索和試驗， 對不同的組織標本最佳冷凍時間取得了一些試驗成果及經驗體會，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取我院病理科2014年1月1日～8月31日婦科快速標本350例，其中上皮組織176例（包括乳腺52例、子宮頸32例、子宮內膜44例、卵巢囊腫48例），致密結締組織63例，疏松結締組織32例，平滑肌組織64例，脂肪組織15例。病種則涵蓋了正常組織、良性腫瘤、交界性腫瘤以及惡性腫瘤。

1.2 液體及儀器設備

①甲醇固定液、H.E染色液、4%中性緩沖甲醛液；②Leica CM1900冷凍切片機、Leica2235石蠟切片機、日本FEATHER一次性刀片、Nikon eclipse 55i顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 冰凍切片的制備及固定 開啟冷凍切片機，使其環境溫度固定在-22℃，冷凍頭-22℃，組織托頭表面放少許OCT包埋劑，放于切片機內備用。規定取材醫生所取組織塊的大小分別為：乳腺2.0 cm×1.5 cm×0.1 cm，子宮頸2.0 cm×0.5 cm×0.1 cm，子宮內膜（含肌壁）2.0 cm×1.5 cm×0.2 cm，卵巢囊壁2.0 cm×0.5 cm，致密結締組織2.0 cm×1.5 cm×0.1 cm，疏松結締組織2.0 cm ×1.5 cm×0.2 cm，平滑肌2.0 cm×1.5 cm×0.1 cm，脂肪1.5 cm×1.0 cm×0.1 cm，將取材醫生切好的組織塊放于冷凍頭上，再用OCT包埋劑裹住組織，放于切片機內讓其自然冷卻。組織冷凍2 min左右時（冷凍剛完全，此時組織中心已開始由紅變白）切片一張，立即放于甲醇固定液中固定，加2 min后再切片一張，同上固定，加5 min后再切片一張，同上固定。以上切片均固定30 s，厚度均為4 μm，然后均執行常規H.E染色。剩余組織放于4%中性緩沖甲醛液中固定3 h，再放于70%酒精中保存，待常規取材時再統一脫水制作成石蠟切片。

1.3.2 H.E染色 將已固定的切片用水沖洗后，放入預至50℃左右的蘇木素染色液中染0.5～1.0 min，取出水洗數秒，用體積分數1%鹽酸乙醇分化，水洗后放入40℃～60℃熱水中藍化。然后置入（5～10）g/L伊紅液染10 s，水洗。體積分數80%～100%梯度乙醇脫水至二甲苯，封固[4]。以上各道酒精及二甲苯中，玻片均震蕩數次，顯微鏡下對其觀察。

1.4 質量評價標準

質量等級分三級：A級：組織結構清晰，染色對比度好，細胞染色質及核膜清楚，細胞大小一致，染色質透明度好，與石蠟切片相差無幾；B級：基本同前，組織結構不夠清晰，但不影響診斷；C級：組織結構不清晰，細胞明顯比石蠟切片大，影響診斷[5]。

2 結果

使用上述方法制得切片，在光鏡下依據染色對比度、組織切片完整情況及組織形態結構等質量評價標準進行分級，見表1。在本實驗中“冷凍2 min左右”時各類組織結構都較清晰，染色對比度好，細胞染色質及核膜清楚，染色質透明度好，而隨著冷凍時間加長，細胞腫脹明顯，細胞間隙加大，組織形態變異較大（圖1～4）。表2為切片能作出正確診斷百分率的統計表，其計算公式：切片能作出正確診斷百分率=（A級例數+B級例數）/（A級例數+B級例數+C級例數）。表1和表2中的石臘切片作為對照列于表格右列。

本試驗共有標本350例，“冷凍2 min左右”時的切片，A級+B級切片之和為332例，占總例數的94.9%，C級為18例，占5.1%；“加2 min后”的切片，A級+B級切片之和為329例，占總例數的94.0%，C級21例，占6.0%；而“加5 min后”的切片，A級+B級切片之和為236例，占總例數的百分率則降為67.4%，C級為114例則升至32.6%。從上述三組數字看，前兩組，總體差異不大，均取得較滿意的效果。而“加5 min后”組與前兩組有比較明顯差距，正確率較差。不過，每一組內不同的標本組織間正確率也不盡相同。應該指出的是，脂肪組織的切片滿意度都不佳，三組正確率均不到50%。

3 討論

3.1關于表格

日常工作中快速診斷結果要從收到標本開始算起30分鐘內完成，為給診斷醫生留有充足的診斷時間，故本實驗采用“2 min左右”、“加2 min后”和“加5 min后”這3個時間段，而2 min左右時組織一般都會凍硬95%左右，均能切出片子。A級和B級的切片均能做出正確診斷，故A級和B級的切片作為同一種類型的切片，而C級的切片不能做出診斷，故其單獨作為一類切片，故能做出正確診斷百分率=（A級例數+B級例數）/（A級例數+B級例數+C級例數）。本實驗中“上皮組織”和“疏松結締組織”在“冷凍2 min左右”、“加2 min后”這兩種情況下，“切片能作出正確診斷的百分率”（以下簡稱百分率）均在92%以上，說明以上皮細胞為診斷依據的病例，要想獲得優良的冷凍切片，最好在拿到組織后5 min之內作出切片，超出這個時間段，即使能切出切片也不利于診斷，甚至會造成誤診。以“致密結締組織”和“平滑肌組織”為主要診斷依據的兩類標本，在“冷凍2 min左右”、“加2 min后”和“加5 min后”這三種情況下的百分率相差不大，說明這兩類標本的冷凍時間對切片的優良率影響不大。脂肪組織在本實驗狀況下，百分率都非常低，說明-22℃不利于脂肪組織的制片。

3.2 最佳冷凍時間

由于病理科日常工作中每日需要面對大量的快速標本，針對不同組織不斷調節冰凍切片機溫度的可操作性不大，一般都是先設定固定的冷凍環境和冷凍頭的溫度，再通過縮短或延長冰凍時間，使組織達到最佳的冰凍切片效果。試驗結果證明，不同的組織種類需要冷凍的時間各不相同。從表2可以看出：上皮組織冷凍的時間越長，正確率就越低。在“冷凍2 min左右時”狀態下，宮頸和卵巢能達100%，而子宮內膜也能達97.7%，而在“加5 min后”均則下降到60%以下。這是因為隨著冷凍時間的延長，細胞內液和細胞外液的失衡就會非常明顯，細胞核腫脹似假復層上皮，異型性大，且細胞器的形態變化也會非常明顯，不易與不典型增生區分開，不利于診斷，甚至可能導致誤診。

表2結果顯示，含纖維成分多的致密結締組織，冷凍時間的長短對制片結果影響不大，試驗中三個時間段正確率均在93%以上。但應該注意的是，纖維成分越多組織的韌性越大，冷凍時間稍長，組織就會堅韌難切，且易出現呈碎屑或條痕狀，這時可在切出完整平面后用戴手套的拇指按壓或在組織切面上哈氣回溫，或將組織拿出在室溫放置15～20 s，使組織回軟后再切，可以避免切片出現粉末[6]，但是這樣會耽誤手術時間，增加患者的痛苦。

此外，富含水分的疏松結締組織冷凍時間超過2 min，正確率雖然下降但并不明顯，超過4 min后， 正確率會急速降至62.5%，可能與水分從膠體狀態的蛋白中分離出來形成冰晶[7]有關。冰晶能引起細胞腫脹，細胞之間相互擠壓出現縫隙，從而使組織失去原有結構，因而導致切片正確率下降，誤診幾率增加。

致于平滑肌組織，表2數據顯示，冷凍時間的長短對正確率沒有太大影響。應該注意的是，冷凍時間稍長，組織就會堅韌很難切，這時只有把該組織放于外環境一段時間或用手撫摸讓其回溫才能好切片，但同樣也會耽誤手術時間。

富含脂肪的組織在-22℃環境下，本試驗未能取得好的結果，正確率均低于50%，表明-22℃狀況下，對于脂肪組織，冷凍時間應大大延長。或者可以將溫度降低到更低溫度，同時增加切片的厚度。亦有文獻報道應用速凍的制片方法制出較好的組織冷凍切片，但和本文的探討目的不同，故未加實驗。

3.3 因材施技

術中快速冰凍切片操作時間比常規切片要短，細胞的形態與常規石臘片相比有較大差異，因此制作一張好的冰凍切片比石臘切片要難。優質冰凍切片應厚薄均勻，完整無皺褶、無裂紋，鏡下組織結構完整，細胞形態清晰，細胞染色上乘，色澤鮮艷[8]。為保證切片有較好的質量，在日常工作中，我們有以下幾點體會：一是標本要新鮮，忌浸入乙醇、甲醛，避免過多的水分，防止組織脫水、冰晶形成和組織變形[9]；二是取材要平整規則，避開壞死出血區，盡量剔除脂肪、毛發、硬骨等[10]；三是要控制組織塊的厚度，不宜太厚，組織越厚，冷凍需要的時間就越長，組織中的水分則會越容易被冰凍形成冰晶， 因此必須保證組織厚度不能超過0.3 cm，并促其速凍避免冰晶的形成。四是要保持刀片的鋒利，防止切片皺縮或卷縮，切片時進刀要緩慢勻速用力均勻，注意修切時暴露出組織的最大切面，并使帶有包膜的組織包膜出現，同時注意清潔，防止切片被污染；五是對于一些小的、零碎的標本，如宮內膜等，應該用較多量的包埋劑包埋；第六要注意的是，切片染色質量的好壞在很大程度上直接影響快速冰凍切片診斷的準確性，因此，染色時盡量振動切片，使組織與固定液、染色液、脫水液盡快融合、分離，加快染色速度，提高快速冰凍切片的成片質量和速度[11]。

冰凍切片的主要技術特點是利用低溫使待檢組織變硬然后制成切片，因其具有方便快速之優勢， 越來越被廣泛使用。然而在冰凍切片過程中有許多制約因素，如操作不當也可引起細胞腫脹、收縮、組織間裂隙，結構不清等人為假象，給診斷帶來風險[12]。可見做好一張冰凍切片不只是會切片那么簡單的問題，還需要病理技術人員具有嚴格的責任心、嚴謹的工作態度、豐富的工作實踐經驗[13]，在日常工作中只有不斷摸索、積累經驗，才能更好地為臨床服務。

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（收稿日期：2014-09-04）