大鼠膈神經放電記錄的實驗綜述報告

摘要：膈神經放電可反映呼吸運動狀態及呼吸中樞的電活動，通過大鼠膈神經放電記錄實驗可使學生系統深入地理解呼吸生理，培養學生綜合分析和解決問題的能力。本文從膈神經放電記錄的詳細過程、注意事項及實驗體會，系統展開綜述報告，為教學及科研需要而進行的該類實驗提供參考。

關鍵詞：膈神經放電；實驗；綜述報告

膈肌是重要的吸氣肌[1]，膈神經作為膈肌唯一的傳出神經便成為觀察呼吸效應的一個最重要的神經結構，同時，膈神經電活動與呼吸中樞電活動密切相關，二者活動變化一致[]，由此可根據膈神經放電活動來反應呼吸中樞神經元放電活動情況，為呼吸相關的科學研究和實驗教學提供客觀指標。

1大鼠膈神經放電記錄實驗的意義

大鼠是基礎科學研究中最常用的嚙齒類小動物，其90%以上的基因與人類相匹配，市場有現成的針對大鼠的各種生物抗體，研究方便，且大鼠最易于長時間飼養和檢測肺通氣功能，便于模擬慢性肺疾病模型，尤其大鼠價格較大動物便宜，可大大降低實驗成本，增加更多學生實踐動手的機會。記錄大鼠膈神經的放電，是項動腦動手能力等要求較高的電生理實驗技術，該實驗能為學生提供一個綜合而系統的學習鍛煉平臺，使其能觀察到呼吸運動的中樞調節過程，了解呼吸運動的電生理記錄方法，從而更深入地理解呼吸的本質。通過系統的實驗過程，能提高學生分析問題和解決問題的綜合能力，更能激發學生的求知欲，開拓其思路，啟發其創新性思維。

2膈神經放電的記錄過程和步驟

2.1 動物麻醉 使用3%戊巴比妥鈉對Sprague Dawley大鼠（300±20g）進行腹腔注射麻醉，以麻醉程度較深為宜（用鑷子夾大鼠前后肢均無痛覺反射，呼吸由胸式轉為腹式呼吸）。若實驗過程中大鼠麻醉程度降低，可酌量追加麻藥。

2.2 氣管插管 大鼠麻醉后仰臥，剔除頸部鼠毛，用碘酒進行消毒，在頸部中線處剪開約1cm小切口，用玻璃分針沿肌縫做鈍性分離，分開筋膜后可見相對較大的甲狀腺，仔細游離甲狀腺與周圍組織，盡量避免損傷血管。再用血管鉗分開頸前肌群，即見白色、有環形軟骨的氣管。一手固定氣管，另一手用剪刀將氣管剪出倒T形切口，順氣管向前下方輕輕送入事先備好的與氣管直徑匹配的干凈插管，并用絲線結扎固定，防止脫落。

2.3 分離膈神經 分離膈神經是記錄膈神經放電的前提，是整個實驗過程的關鍵環節，直接影響實驗的成敗，因為大鼠的膈神經比家兔的更細，對做慣了家兔實驗的大多同學來講，此步更是實驗的難點。具體包含以下步驟：①動物仰臥和分離頸前肌群：在分離膈神經前應盡量將大鼠仰臥，且頭偏向要分離的膈神經的對側，這樣可在尋找、分離時充分地暴露膈神經；用彎頭小鑷從頸外靜脈和胸鎖乳突肌之間的血管肌肉間隙向深層作鈍性分離，直至脊柱旁；②辨認膈神經：大鼠膈神經主要由第Ⅳ、Ⅴ對頸神經的腹支匯合，從斜方肌的腹緣進入胸腔，沿心包和中膈下行支配膈肌。在頸部脊柱旁，可看見粗大、并且斜向前肢走行的白色臂叢神經，用棉簽細心分開脊柱表面的結締組織，可觀察到從臂叢神經發出的頭發絲粗細的膈神經緊貼著斜方肌垂直下行（注意這里只有膈神經是垂直往下走行的）。③剝離膈神經：正確辨認膈神經后，用光滑、頭端鈍圓且彎曲的細玻璃分針，蘸少許生理鹽水，從膈神經的外周端輕輕將神經周圍的結締組織剝離掉（不要在神經上來回擦動免傷神經），游離出約1cm的膈神經，在其下穿黑線標記備用。用蘸有溫熱生理鹽水的棉球濕潤神經。④頸外靜脈插管：在分離膈神經的對側頸部切口處，從外上到內下小心分離皮下組織，顯露并分離頸外靜脈，結扎遠心端，并用血管夾夾住近心端，于頸外靜脈管壁剪一\"V\"形切口，切入深度為靜脈的1/3？郯1/2，沿此切口將備好的充滿生理鹽水的PE導管插入約1.5？郯2.0 cm，用線結扎固定2道。導管的另端連接三通管，用注射器回抽有血，注入生理鹽水無阻力、無滲漏則表明導管位置合適，且沒有扭轉。后續實驗中大鼠需追加麻藥時可直接通過三通管進行，若大鼠需較長時間實驗，三通管也可連接微量注射泵，緩慢而勻速地補充生理鹽水，能維持大鼠以較好的狀態。⑤縫合頸部切口：膈神經分離后將標記好的線盤曲一團（較顯眼），以貼近神經處放置。手術縫合應按解剖層次分層進行，不要卷入或縫入其他組織。縫合的創緣距與針間距要均勻一致，這樣受力及分擔的張力一致并且縫合嚴密，皮膚縫合松緊度合適，既可防止后續實驗中因縫合不嚴而致滴加的石蠟液在皮兜中滲漏，也可預防因縫合過緊影響到大鼠呼吸及膈神經放電。⑥背側找到膈神經：縫合后將大鼠翻轉，在頸背后進行手術，沿膈神經分離側斜方肌向深部鈍性分離，貼肌縫下行，找到標記的黑線團，小心挑起膈神經，滴加預溫37℃的石蠟液保護膈神經。

2.4記錄膈神經放電 ①鉤掛膈神經：把大鼠連同鼠板移入銅網屏蔽室，使用立體定位儀將大鼠固定在實驗臺上（以便觀察中樞微量注射藥物對膈神經放電的影響），利用鼠板上的立柱，穿線鉤掛，做好皮兜，充分暴露膈神經，滴加石蠟液浸泡神經。將鉤狀鉑銥合金雙極電極固定于三維調節器上，移動調節器，使電極接近膈神經，勾住膈神經后再輕輕抬起電極。②放電記錄：打開Biopac 16導電生理記錄系統（美國），設置好電極對應的通道（通道A1至A16分別對應1-16個通道，采集信號可以通過硬件上的通道選項選擇；從MP150菜單中選擇Setup Channels，通過出現的Input Channels對話框設置采集信號的通道。），指定采集設置（包括：數據存儲、采集速率、采集持續時間等參數），點擊START按鈕，可見膈神經呈簇狀放電（見圖1）。使用結束后要及時保存數據，關閉電源。

3注意事項及實驗體會

3.1 麻醉 嚙齒類動物對急性缺氧的耐受性較低，對麻醉藥所致呼吸抑制作用比較敏感，麻醉過深易造成實驗動物發生呼吸抑制，如不能盡快完成氣管插管極易致實驗動物死亡；麻醉過淺則可能在插管及后面的膈神經分離過程中造成強烈應激，嚴重影響動物的生理狀態。因此麻醉時，力爭一次麻倒大鼠，這就需要在老師的指導下認真操作，大鼠要抓牢，進針位置要靠大鼠下腹部，注射器針體要傾斜30°左右，進針1cm后回抽無血、無阻塞再注射藥液，確保藥物進入腹腔。實驗過程中，當麻醉程度降低時要及時追加麻藥（頸外靜脈插管補充麻藥），保持偏深的麻醉狀態。往往在做完手術正式引導膈神經放電時，動物開始清醒，出現掙扎，這時也最容易損傷膈神經，所以應追加麻藥，以免影響實驗結果。

3.2氣管插管 頸部切口要正中，頸部肌肉和筋膜時要鈍性分離，盡可能找到肌縫，分開即可見到氣管，一定要避免損傷血管，引起大出血和過多組織液滲出；實驗前要多準備些粗細不等的氣管插管，根據實驗鼠的體重范圍選擇相應直徑的插管，插管要盡量輕柔、快速，因為插管本身對氣管壁就是個很強烈的刺激，易使氣道分泌物增多，插管內或氣道內黏液阻塞，引起大鼠窒息。插管過程中要緊密關注大鼠狀況，若氣道分泌物增多，應及時用細紙條或注射器針頭清理。

3.3分離膈神經 找準并成功分離膈神經是記錄膈神經放電實驗的關鍵步驟。尋找膈神經時緊貼頸總動脈分離，找到白色成束狀向前肢方向移行的臂叢，斜搭在臂叢根部的與氣管平行、狀如頭發絲且透明有彈性的神經即為膈神經。分離時應把神經周圍的結締組織分離干凈，分離過程要小心仔細，注意保護神經，不能用金屬劃神經，以免損傷，滴加生理鹽水，防干。勾掛膈神經時把事先放置在膈神經下方的手術線輕輕提起，拉動膈神經輕輕搭在電極上，使電極懸空，不要觸及周圍的肌肉等組織。

3.4神經放電記錄過程中的干擾排除 干擾的來源是多方面的，首先要確定其來源是物理性的還是生物性的[3]，其次是利用引導電位的路徑采用摒除、隔離分析等方法尋找干擾來源，要有針對性地逐一排除。①靜電及電磁干擾的排除：靜電及電磁為常見干擾，采用屏蔽室、屏蔽網進行屏蔽，對電源線路盡可能屏蔽，且所有屏蔽材料均需接地。將地線與引導線遠離帶電流的導線，記錄儀器的輸入部分遠離靜電場或電磁場，且儀器本身也要通過外殼接地。注意交流電50Hz的影響，屏蔽室內不要設置帶電源的未進行屏蔽的物體，如臺燈、日光燈、實驗臺的保溫裝置等，確因需要，也盡量在記錄時關閉。②生物性干擾的排除：實驗動物可通過切口附近引導接地。盡量使實驗動物處于深度麻醉，此時，動物呼吸平穩、肌肉松弛，要使實驗動物處于良好的狀態，記錄時間長時要保溫、補液，神經要浸泡在預溫的石蠟油中，防止實驗標本逐漸干燥。膈神經上不能有血塊、毛發等雜質附著。

3.5 神經放電信號的辨認 很多同學在一開始容易把干擾信號誤當作膈神經放電，膈神經放電的基本特征是：在背景放電（噪聲）的基礎上，成束的節律性放電，而且可觀察到電腦屏幕上的放電波形與動物的吸氣運動以及監聽器中發出的放電聲音三者同步。

參考文獻：

[1]趙春玲，馮志強，陳燕，等.大鼠膈神經和迷走神經放電以及呼吸和心電圖同步記錄技術[J].瀘州醫學院學報，2007，30（2）：90-91.

[2]盧記明，張炳熙.大鼠氣管插管方法學概述[J].中國比較醫學雜志，2009，19（8）：76.

[3]李小英，羅榮敬，周樂全，等.電生理實驗中的常見干擾及其排除方法[J].中華臨床醫學研究雜志，2005，11（14）：2096.編輯/王海靜