鮑曼不動桿菌耐藥性監測與外排泵adeB基因存在狀況分析

摘要：目的 探討我院臨床分離鮑曼不動桿菌的耐藥性及外排泵adeB基因存在狀況。方法 WHONET5.6回顧性分析鮑曼不動桿菌耐藥性，聚合酶鏈反應(PCR)擴增檢測adeB基因。 結果 2011年，鮑曼不動桿菌對頭孢菌素類、碳青霉烯類、β-內酰胺酶抑制劑、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物均較敏感，耐藥率幾乎均在40%以下，2012年出現較大幅度上升，對5大類抗菌藥物的耐藥率幾乎均在50%以上，2013年變化不明顯；鮑曼不動桿菌外排泵adeB基因陽性率高(80.9%)，多重耐藥菌adeB基因陽性率(89.7%)明顯高于相對敏感菌adeB基因陽性率(37.5%)(P<0.05)。結論 鮑曼不動桿菌耐藥情況嚴重，adeB基因陽性率高；主動外排在鮑曼不動桿菌多重耐藥中可能發揮重要作用。

關鍵詞：鮑曼不動桿菌；外排泵；adeB基因

Investigation of Acinetobacter Baumannii Drug Resistance and Analysis of Existence of Efflux Pump AdeB Gene

WU Ze-cai1，DENG Zheng-hua1，LUO Qian2

(1.Department of Laboratory Medicine，The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，Sichuan，China; 2. Department of Laboratory Medicine， The First People's Hospital of Neijiang City， Luzhou 646000，Sichuan，China)

Abstract：Objective To investigate the drug resistance of Acinetobacter baumannii clinical isolates in our hospital and the existence of efflux pump adeB gene. MethodsAnalysis retrospectively of drug resistance of Acinetobacter baumannii based on WHONET5.6. And the polymerase chain reaction(PCR)was used to amplify the adeB gene. ResultsIn 2011， acinetobacter baumannii were sensitive to the cephalosporin class， carbon penicillium alkene， β- lactamase inhibitor， fluoroquinolone and aminoglycoside antibiotic drugs， The resistant rates to almost were all below 40%.But it appeared a relatively substantially rise in 2012， the resistance rates to five categories of antibacterial drug were all above 80%.there were no change obviously in 2013.The rate of efflux pump adeB gene in acinetobacter baumannii is high(80.9%). The positive rate of adeBgene in multi-resistant bacteria(89.7%) was significantly higher than sensitive bacteria (37.5%) (P< 0.05). ConclusionThe drug resistance of Acinetobacter baumannii is in severe cases ，and the detection rate of adeB gene is high. The active efflux pump might play an important role in the formation of multi-drug resistance of Acinetobacter baumannii.

Key words：Acinetobacter baumannii; Efflux pumps; AdeB gene鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，AB)廣泛存在于醫院環境中，如醫護人員的手部、患者用具、呼吸機設備、消毒液、透析機、水龍頭等，是最常見的條件致病菌之一，可以引起多種醫院感染，如肺炎、傷口感染、敗血癥和腦膜炎等。隨著抗菌藥物的廣泛使用，多重耐藥AB不斷發展，給臨床治療帶來很大困難，研究AB耐藥情況，可為合理選擇抗菌藥物，采取有效治療措施防止耐藥菌株進一步擴散提供理論依據。為探討耐藥情況及耐藥基因存在狀況，本研究對近3年我院臨床分離AB耐藥性進行了回顧性分析，對部分菌株進行了外排泵基因adeB檢測和分析。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1菌株47株AB分離自2011年1月~2013年12月我院門診和住院患者送檢的各類標本，所有菌株均采用西門子公司MicroScan WalkAway-96 plus細菌鑒定和藥敏測試系統進行鑒定和藥物敏感試驗。其中相對敏感菌(對氨基糖苷類、氟喹諾酮類和β-內酰胺類均較敏感)8株，多重耐藥菌(對頭孢菌素類、碳青霉烯類、β-內酰胺酶抑制劑、氟喹諾酮類和氨基糖苷類中的3類及以上耐藥）39株。質控菌株為大腸埃希菌25922，銅綠假單胞菌27853。

1.1.2儀器與試劑西門子公司MicroScan WalkAway-96 plus鑒定和藥敏測試系統，配套試劑及NC50反應板；C1000TM Thermal Cycle PCR擴增儀與凝膠成像儀為Italy Bio-RAD公司產品；引物及試劑購自上海生工生物工程股份有限公司；培養基均購自重慶龐通醫療器械有限公司。

1.2方法

1.2.1細菌鑒定與藥敏試驗病原菌的分離、鑒定和藥敏試驗嚴格按臨床檢驗操作規程及儀器說明書進行。

1.2.2細菌耐藥性分析用WHONET5.6軟件回顧性分析我院2011年~2013年臨床分離AB的藥物敏感性資料。

1.2.3 adeB基因檢測

1.2.3.1模板制備將保存的細菌接種于血平板上，置于37℃ CO2培養箱孵育18~24h后，采用煮沸法[1]，挑選純菌落置入EP管內(內置1ml生理鹽水)混勻后13500rpm 離心10min，棄上清后，加25ul裂解液充分混勻，100℃10min，13500rpm離心10min。上清液即為基因檢測模板液。

1.2.3.2 PCR擴增引物由Primer5設計，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，adeB引物序列: P1 5′-TACCGGTATTACCTTTGCCGGA-3′， P2：5′-GTCTTTAAGTGTCGTAAAAGCCAC-3′，產物長度約250bp。PCR反應體系為50ul，其中10×緩沖液10ul，25mmol/L MgCl2 4mL，dNTPs(各2.5mmol/L)混懸液1ul， taqDNA聚合酶(5U/μL)0.5ul，dH2O 31ul， 上下游引物（10umol/L）各0.5ul，DNA模板液2.5ul。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，52℃復性50s，72℃延伸1min，共30個循環，最后72℃延伸7min，PCR產物經1.2%的瓊脂糖凝膠（含EB）電泳檢測擴增產物，凝膠置紫外光線下觀察結果， 并經凝膠成像系統掃描成像，產物經瓊脂糖凝膠電泳出現與目的基因相對分子質量相當的條帶為陽性[2]。

2結果

2.1 AB耐藥性2011年~2013年我院臨床分離AB耐藥性見表1。

2.2外排泵adeB基因 PCR擴增結果adeB基因 PCR產物電泳結果見圖1，在分子量250 bp大小附近多重耐藥組和相對敏感組均可看到一條特異性的條帶，銅綠假單胞菌為陰性對照，未見此擴增片段。47株臨床分離鮑曼不動桿菌adeB基因陽性率為80.9%，其中，多重耐藥組與相對敏感組陽性率分別為89.7%（35/39） 和37.5%（3/8），差異有統計學意義(χ2為8.572，P<0.05)。（擴增產物通過序列測定和BLAST比對分析，確定為adeB基因部分核苷酸序列。）

圖1adeB基因 PCR產物電泳圖譜

3討論

AB是醫院感染的重要條件致病菌，在免疫力低下、接受侵襲性操作的患者中，可以引起呼吸機相關肺炎、泌尿系統感染、敗血癥、腦膜炎和手術傷口感染等嚴重的甚至致死性的感染。其分離率位居我國臨床常見革蘭陰性桿菌第3位，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌[3]。

AB的耐藥率近年呈不斷上升趨勢，耐藥譜日趨廣泛。分析近3年我院臨床分離AB的耐藥情況，2011年耐藥率較低，對大部分抗菌藥物較敏感，2012年耐藥率出現了大幅度上升，分離出了多株多重耐藥，甚至泛耐藥菌株，耐藥形勢非常嚴峻。AB耐藥機制十分復雜，與滅活酶產生、膜蛋白缺失、主動外排泵過度表達以及基因突變有關[4]。多重耐藥的菌株一般都會合并幾種耐藥機制，其中以主動外排系統介導多種抗菌藥物的敏感性下降或耐藥最為普遍。

主動外排系統廣泛存在于革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌及哺乳類細胞中，它可以將底物排出細胞外，從而保護細胞免受毒性生物分子的侵害。細菌的外排泵系統可分5大類：ATP結合盒轉運體家族(ATP-binding cassette family， ABC)、主要易化因子超家族(the major facilitator superfamily， MFS)、藥物與代謝物轉運體超家族(the much larger drug/metabolite transporter superfamily， DMT)及與之相關的小多藥外排家族(the small multidrug resistance family， SMR)、多藥物與毒物外排家族(the multidrug and toxic compound extrusion family， MATE)、耐受-生節-分裂家族(the resistance-nodulation-division family， RND) [5-7]。AdeABC是重要的AB外排泵系統，調控基因為adeR，adeS。比較基因組學研究發現，表現為多藥耐藥的鮑曼不動桿菌AYE株存在AdeABC外排泵系統，而敏感株SDF株則無該外排泵系統[8]。因此，adeB基因可作為AdeABC外排泵系統的遺傳標記。AdeABC外排系統屬于RND家族，能夠泵出氨基糖苷類、頭孢他啶、替加環素、氯霉素、甲氧芐氨嘧啶和喹諾酮類抗菌藥物[9]。

本文應用PCR技術在47株臨床分離AB中檢出主動外排基因adeB陽性38株，陽性率為80.9%，其中，多重耐藥組與相對敏感組adeB基因陽性率分別為89.7%（35/39） 和37.5%（3/8）。可見多重耐藥菌株的主動外排基因adeB陽性率明顯高于相對敏感菌株。提示AdeABC外排泵系統的耐藥基因adeB與AB的多重耐藥密切相關，由外排泵介導的耐藥性在AB多藥耐藥中發揮了一定的作用。

綜上所述，在面對細菌耐藥性不斷發展的情況下， 合理應用抗菌藥物是減少多重耐藥的重要措施，AB耐藥機制復雜，與滅活酶產生、膜蛋白缺失、主動外排泵過度表達以及基因突變有關。本文通過分析了鮑曼不動桿菌AdeABC外排泵系統中外排泵基因adeB分布情況，說明了AdeABC主動外排系統在介導AB多重耐藥性的形成中具有一定的作用。

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編輯/哈濤